專利名稱：高生物利用度改性果膠制備工藝及抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多糖的制備工藝及應(yīng)用，尤其涉及一種高生物利用度改性果膠的制備工藝及其在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
提高生物活性、降低毒性、提高生物利用度是開發(fā)新藥，獲得成功的重要方法。提高生物利用度，對于高分子藥物意義尤其重大。果膠(pectin)是一種主要來源于植物的多糖，產(chǎn)生于較為高等的植物初級細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，它是一個異型分支(heterogeneous branched)的雜多糖家族。幾乎所有的植物中都含有果膠，柑橘、蘋果等水果含量尤為豐富。果膠被世界糧農(nóng)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)等機(jī)構(gòu)確定為食品原料，證實了其安全性。以果膠為原料制備抗腫瘤藥物或功能食品，是其區(qū)別于具有較高毒性的化療藥物的優(yōu)勢之一。某些多糖其生物活性與其高級結(jié)構(gòu)有關(guān)；某些多糖其生物活性僅與其線性結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于后者，分離其活性片斷、簡化其分子(例如通過降解多糖獲得低分子多糖)，有利于富集其“藥效基團(tuán)(pharmacophore) ”，提高多糖的“類藥性(druglikeness) ”和生物活性。 果膠一詞描述的是這樣一組多糖其分子中存在大量部分甲酯化的半乳糖醛酸和少量鼠李糖。果膠結(jié)構(gòu)由兩部分組成長長連續(xù)的、“平滑的”同聚半乳糖醛酸(homogalacturonan， 縮寫作HG)骨架，以及短短的、“毛發(fā)狀的”(hairy region or ramified region)鼠李糖半乳糖醛酸聚糖支鏈。α -(1 — 4)糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸單元被(1 — 2)糖苷鍵連接的鼠李糖殘基插入，形成鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan，縮寫作RG)。4)- α -D-GalpA-(1，2)- α -L-Rhap-(1，果膠毛發(fā)區(qū)分為RG-I和RG-II兩類。連接有半乳糖、木糖和阿拉伯糖等中性糖側(cè)鏈的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，稱為RG-I。RG-II含有非常復(fù)雜的中性糖支鏈，例如芹菜糖 (apiose)、2-酮-3-脫氧辛糖酸 Q-keto-3-deoxy-octanoic acid, KD0)，但半乳糖殘基含
量不顯著。天然多糖往往生物活性缺失或很低，但經(jīng)過改性可提高其生物活性。多糖常作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(biological response modifier, BRM)起作用，而作為BRM首先要求生物體能夠吸收它，即具有高生物利用度。對果膠進(jìn)行改性，提高其生物利用度可提高生物活性便是多糖改性成功的例子。果膠在腫瘤預(yù)防、治療中的應(yīng)用早有研究。據(jù)李時珍《本草綱目》記載“乳癌(乳房內(nèi)有核如指頭，不痛不癢，五、七年成癰，名乳癌)。用青皮四錢，加水一碗半煎成一碗，徐徐服下。一天服一次，或用酒送服亦可?！边@里所述的青皮指柑橘皮。用現(xiàn)代的觀點推斷，存在于柑橘皮中的果膠多糖經(jīng)過煎煮使得長鏈被打斷變成短鏈并易于被血液吸收。研究較多的果膠的抗癌活性是其抗結(jié)腸癌活性[高林.MCP多糖的制備、分析鑒定及其抗腫瘤作用的研究[D].天津大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005;張文博.改性柑橘果膠的制備、表征及抗癌活性D)].天津大學(xué)博士學(xué)位論文，2006]。早期的果膠抗腫瘤研究通常都是指不溶性果膠，其抗癌機(jī)理可能與其作為膳食纖維(dietary fiber)的功能有關(guān)。
對果膠改性以提高其抗腫瘤活性并擴(kuò)大其“抗癌譜”，其一需要提高其生物利用度，其二需要富集和暴露其“藥效基團(tuán)(pharmacophore) ”。改性柑橘果膠(modified citrus pectin, MCP)是通過水解天然柑橘果膠(CP)而獲得的一種分子量更小、酯化度(degree ofmethylation,DM)更低、分支更短的果膠多糖，是果膠改性成功的典范。與CP相比，酸堿降解后的果膠更易被小腸微絨毛吸收，并直接進(jìn)入血管進(jìn)而在體內(nèi)存留。Platt等[Platt D, Raz A. Modulation of the Lung Colonization of B16-FIMelanoma Cells by Citrus Pectin [J], J Natl Cancer Inst. 1992，84 (6) :438-442.]報道，注射 MCP 可明顯減少小鼠植入B16-F1黑色素瘤細(xì)胞后的肺部集落，而CP則增加其肺部集落。MCP可能通過與腫瘤表面過表達(dá)的半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)相互作用而起到抗腫瘤轉(zhuǎn)移等作用。 目前國內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)與公司，通過降解柑橘果膠或者其他類型的果膠以獲得分子量更低、酯化度更低能夠被人體吸收，具有抗腫瘤活性的低分子量改性果膠(Modified Pectin with High Bioavailability, low molecular mass and antitumor activities,本文簡禾爾 MPHB)。MCP中末端半乳糖殘基可能起到識別Gal-3的作用，從而具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移等活性。 酯化度、糖醛酸含量等可能影響MPHB在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解等過程。MCP具有較低的 DM。果膠在較高DM(超過30% )時，主要在腸道起作用[Kunz etal. Method for producing pectin hydrolysis products[P],美國專利:7960351,2010-06-14.]；較低DM則能不僅增強(qiáng)果膠的水化度，而且可能還會使MCP易于接近體內(nèi)靶點。雖然果膠HG與毛發(fā)區(qū)對于免疫增強(qiáng)活性或凋亡誘導(dǎo)活性可能有貢獻(xiàn)，但尚無確切結(jié)論，而且果膠高級結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性之間的關(guān)系尚無系統(tǒng)研究。張文博等[張文博等.改性柑橘果膠的制備、表征及抗癌活性[J]·高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2010，31 (5) :964 969.]制備的MCP其骨架結(jié)構(gòu)主要為HG和 RG-I，并含有末端半乳糖，據(jù)作者推測，與RG-I相連的分支結(jié)構(gòu)可能是該多糖抗腫瘤活性的關(guān)鍵位點。果膠既可以通過酸堿處理(化學(xué)法)、也可以通過酶法處理(生物法)獲得適宜的酯化度(degree of methylation，DM)、適宜分子量的低分子量改性果膠。堿皂化反應(yīng)， 降解半乳糖醛酸甲酯鍵，在降低酯化度的同時，發(fā)生消除反應(yīng)，能降低果膠分子量。果膠進(jìn)一步經(jīng)過高溫酸解，分子量繼續(xù)降低。皂化與酸解過程發(fā)生一種脫皮效應(yīng)(peeling effect)，導(dǎo)致果膠毛發(fā)區(qū)部分或完全被降解，中性糖含量降低。事實上，HG的糖苷鍵受到羧酸根的影響，在酸處理下的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于中性糖組成側(cè)鏈對酸的穩(wěn)定性。果膠，尤其是酯化度高的果膠，幾乎完全不能溶解于水，生物利用度幾乎為零。將果膠與水混合，其狀態(tài)與普通淀粉和水混合的狀態(tài)一致，即團(tuán)塊表面已經(jīng)逐步水化、溶脹，而團(tuán)塊中心可能仍然干燥。采用規(guī)模較大的容器對果膠進(jìn)行降解之初期，有些團(tuán)塊完全懸浮于溶液主體表面；有些團(tuán)塊粘附于容器壁；有些團(tuán)塊沉淀在容器底部。即便攪拌速度很快，這些團(tuán)塊表面發(fā)生皂化后，仍然有很多果膠尚未發(fā)生反應(yīng)。但是，由于皂化反應(yīng)、脫皮效應(yīng)、β -消除反應(yīng)等過程幾乎同時進(jìn)行，導(dǎo)致部分果膠片段分子量過小，成為分子量小于2000道爾頓(簡稱Da) 的果膠寡糖或皂化完全的果膠酸(pectic acid)；部分果膠尚未充分反應(yīng)，成為溶解度差、 難以吸收的膠狀果膠。這種酸堿降解的工藝，在產(chǎn)能放大時，導(dǎo)致分子量分布嚴(yán)重變寬。此夕卜，據(jù) Jackson 才艮道[Jackson CL et al. Pectin induces apoptosis in human prostate cancer cells !correlation of apoptotic function with pectin structure [J]. Glycobiology, 17 (8) :805-819.]，經(jīng)過堿處理的果膠將失去誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，而加熱處理是使果膠獲得誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力的關(guān)鍵因素。Sathisha UV等[Sathisha UV, et al. Inhibition of galectin—3 mediated cellular interactions by pectic polysaccharides from dietary sources [J]. Glycoconj J. 2007，24 (8) :497-507.]對從燕麥、印度菝葜、黑色小茴香種、姜、柑橘等六種植物提取的果膠半乳糖凝集素活性抑制情況進(jìn)行了比較，其結(jié)果表明，半乳糖等中性糖含量高的果膠，其半乳糖凝集素酶抑制活性越高?？傊?，通過酸堿處理果膠，果膠毛發(fā)區(qū)降解程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于主鏈HG降解程度，不利于控制分子量與分子量分布，不利于保持毛發(fā)區(qū)的含有末端半乳糖的活性結(jié)構(gòu)，而不一致的降解程度導(dǎo)致不一致的活性。MCP已經(jīng)證實能夠在腫瘤生長、腫瘤血管生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起抑制作用。以含有RG-II結(jié)構(gòu)的果膠為原料制備的MCP，具有幫助體內(nèi)排出鉛等重金屬的作用，這種作用可能與半乳糖醛酸的螯合作用有關(guān)。MCP是一種特殊的MPHB。在研究MPHB 的過程中，其抗腫瘤活性與結(jié)構(gòu)特征之間的構(gòu)效關(guān)系必將更加清晰。通過專性酶解析果膠結(jié)構(gòu)是研究其構(gòu)效關(guān)系的主要方法。降低分子量是使藥物候選物(drug candidate)獲得“類藥性(druglikeness) ”的重要方式，降低果膠分子量的同時有助于增加其生物利用度。對于己糖醛酸而言，降低酯化度之后，羧酸之鄰位效應(yīng)導(dǎo)致酸降解果膠主鏈HG的糖苷鍵效率大大下降；而酶對于降解果膠主鏈糖苷鍵效率高。果膠酶(pectinase)是一類降解果膠的酶的總稱，有時也專指果膠內(nèi)切酶(Polygalacturonase 或 pectic enzyme, EC 3· 2· 1· 15，簡稱 PG 或 endo-PG)。PG 能專一裂解果膠的HG部分，使果膠分子量下降。果膠酯酶(pectinesterase，EC 3. 1. 1. 11) 能專一性降解聚半乳糖醛酸與羧基相連的甲氧基。酶作用于果膠，條件溫和可控，不存在脫皮效應(yīng)、消除反應(yīng)等過程，在降低分子量與酯化度的同時，不會導(dǎo)致果膠毛發(fā)區(qū)中性糖含量的下降。而保持RG-I結(jié)構(gòu)的相對完整性，并可能富集果膠的藥效位點-末端半乳糖殘基，這些步驟可能對于保證MPHB具備抗腫瘤活性非常關(guān)鍵。經(jīng)PG降解后的果膠，通常可以使分子量小于70000Da。對于某些高分子量果膠原料，根據(jù)原料果膠結(jié)構(gòu)的差異，經(jīng)PG處理后，需要補(bǔ)加鼠李糖半乳糖醛酸酶、木聚糖酶或阿拉伯聚糖酶，才能高收率地獲得低分子量果膠。當(dāng)前制備具有抗腫瘤活性低分子量果膠的工藝普遍采用乙醇或甲醇沉淀法純化[Piatt. Modified pectin [P],美國專利7491708, 2009-02-17 ；范曉青.低分子柑桔果膠用于調(diào)節(jié)血糖血脂和改善脂肪肝中的應(yīng)用[P].中國專利200610051667.X， 2006-12-27.]。但產(chǎn)物的分子量分布(polydispersity，PD)往往在2以上，而且隨著規(guī)模的放大，分子量分布不斷加大。此外，乙醇沉淀法獲得的產(chǎn)品往往混有較多的氯化鈉。Kimz 等[Kunz et al. Method for producing pectin hydrolysis products[P].美國專利 7576070,2009-08-18.]采用離心或過濾的方式純化多糖。但是，由于果膠黏度大，離心或普通的過濾方法不適宜處理大量樣品，在中試或產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域沒有應(yīng)用前景。超濾法具有分子級分離，無相變，無污染，條件易控制等優(yōu)點。采用錯流過濾模式可以有效地避免濃差極化現(xiàn)象及減少膜污染。將適量的酶加入果膠稀溶液，采用邊降解，邊過濾的方式，可以實現(xiàn)在線分離。這種反應(yīng)與分離同時進(jìn)行的模式，可以有效提高M(jìn)PHB收率。多糖含有大量羥基，不易干燥。如果采用普通烘干或加熱真空干燥的工藝，產(chǎn)品容易凝結(jié)成塊、硬度大、顏色深，所以少量樣品往往采用冷凍干燥的方式。但是由于冷凍干燥工藝成本太高，不適宜大規(guī)模制備樣品。噴霧干燥、微波干燥都是工業(yè)上的高效烘干方法， 能夠處理大批量物料。通過進(jìn)料多糖含量、進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度、進(jìn)風(fēng)壓力等參數(shù)可以優(yōu)化噴霧干燥的條件，獲得粉末狀產(chǎn)品。微波干燥設(shè)備簡單、干燥速率快。作為一種BRM，包括MPHB在內(nèi)的多糖，常會表現(xiàn)出量效關(guān)系不明顯的現(xiàn)象。腸道吸收促進(jìn)劑(intestinal absorption enhancers，IA^有利于提高多糖類藥物的生物利用度，減少病人用藥量，減輕量效關(guān)系不明顯的影響。并非所有的IAE對多糖吸收都有促進(jìn)作用。許多腸吸收促進(jìn)劑具有細(xì)胞毒性，從而影響了 MPHB的藥效作用。有些IAE則對MPHB 無吸收促進(jìn)作用。經(jīng)Caco-2細(xì)胞模型篩選，表明癸酸鈉、η-月桂基-β-D-麥芽吡喃糖苷等IAE對MPHB具有良好的吸收促進(jìn)作用且無明顯毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種制備改性果膠MPHB的新工藝。本發(fā)明的目的還在于提供一種規(guī)?；a(chǎn)MPHB的純化方法及質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種MPHB的應(yīng)用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案包括為了制備ΜΡΗΒ，原料果膠在加熱條件下用水溶解和溶脹，用碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)ρΗ至 4. 5 8. 5之間(果膠溶液通常偏酸性)，冷卻溫度達(dá)到或略高于果膠酯酶(EC 3. 1. 1. 11) 的最適反應(yīng)溫度，并以果膠酯化度達(dá)到0.4%至10%范圍內(nèi)為反應(yīng)終點。降低溫度，達(dá)到適合聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 15)或果膠裂解酶(EC4. 2. 2. 10)進(jìn)行催化的條件反應(yīng)，用該兩種酶中的一種或其組合控制分子量及分子量分布，產(chǎn)物經(jīng)膜過濾、脫鹽、濃縮與干燥獲得改性果膠MPHB。干燥方法包括但不限于噴霧干燥、微波干燥、紅外干燥和冷凍干燥。為了控制MPHB的分子量與分子量分布，同時為了得到較純的產(chǎn)品，采取多次膜過濾法，便于工藝放大。采用超濾膜，以錯流過濾模式進(jìn)行操作。首先以第一組截流分子量 (MWCO)在^OOOODa到70000Da之間的膜進(jìn)行過濾以除去大分子果膠與果膠酶，起到純化和降低第二組膜操作壓力的作用，操作壓力維持在0. 08-0. 30MI^之間；濾出液采用第二組膜 (其MWCO在IOOOODa到70000Da之間)進(jìn)行過濾，操作壓力維持在0. 06-0. 20MPa之間，操作溫度維持在30-45°C。如果膜的操作壓力過大，可以在料液中適度添加聚半乳糖醛酸酶或果膠裂解酶。使用MWCO在2000Da 200Da之間的超濾膜或納濾膜，濾除小分子部分，其中包括鹽(例如碳酸鈉)、果膠寡糖等成分。 為了使MPHB具有抗腫瘤活性，其質(zhì)量控制需采取如下方案原料果膠需具備RG-I 結(jié)構(gòu)，毛發(fā)區(qū)需含有半乳寡聚糖、產(chǎn)物MPHB需含有末端半乳糖殘基結(jié)構(gòu)；產(chǎn)物分子量需在 70000Da到2000Da之間；產(chǎn)物酯化度介于0. 4%至10%之間。為了提高M(jìn)PHB的生物利用度，可在口服配方中添加腸道吸收促進(jìn)劑。腸道吸收促進(jìn)劑包括但不限于中鏈脂肪酸鹽、膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、殼聚糖及其衍生物、卡波姆、十二烷基麥芽糖苷。本發(fā)明的有益效果在于本制備工藝的方案有利于規(guī)?；苽銶PHB ；有利于控制分子量及其分布；有利于脫除鹽類等小分子雜質(zhì)、純化產(chǎn)品和質(zhì)量控制；有利于替代使用污染環(huán)境的鹽酸和氫氧化鈉的工藝；添加腸道吸收促進(jìn)劑的技術(shù)方案有利于提高M(jìn)PHB的生物利用度。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例一稱取5kg酯化度為60%的柑橘果膠，加入5000L水，混合，加熱至60°C，保持12h， 以充分溶脹；冷卻至45°C，向同一容器內(nèi)用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0，加入市售果膠酯酶， 攪拌均勻。經(jīng)測定，果膠酯化度降低到時，升溫至80°C保持lh，以終止果膠酯酶的作用。 向同一容器內(nèi)加入市售聚半乳糖醛酸酶，經(jīng)酶降解，采用高效凝膠色譜檢測分子量及分子量分布，使產(chǎn)物主要組分峰均分子量在70000Da到2000Da的范圍。采用第一組截流分子量 (以下簡稱MWC0)為IOOOOODa的膜，分離除去高分子量果膠和酶；采用MWCO 45000Da的第二組膜濃縮果膠溶液，如果過濾操作壓力超過0. 30MPa且持續(xù)不降低，則補(bǔ)加少量聚半乳糖醛酸酶和鼠李糖半乳糖醛酸酶，繼續(xù)過濾。濾出液采用MWCO為2000Da的第三組膜濃縮果膠溶液，同時除去寡糖、鹽等小分子組分，濃縮，產(chǎn)物經(jīng)微波干燥，獲得具有抗腫瘤活性可口服的4. 25kg改性果膠MPHB。實施例二稱取IOOkg酯化度為40 %的櫳柑(ponkan)皮果膠加入1000L水，混合，加熱至 950C，保持3h，溶脹；冷卻至55°C，向同一容器內(nèi)用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH至4. 5，加入果膠酯酶，攪拌均勻。經(jīng)測定，果膠酯化度降低到0.4%時，升溫至90°C保持30min。向同一容器內(nèi)加入果膠裂解酶，經(jīng)酶降解，使產(chǎn)物主要組分峰均分子量在50000Da到2000Da的范圍。采用MWCO為70000Da的膜，分離除去高分子量果膠和酶；采用MWCO為45000Da的膜濃縮果膠溶液，產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥，獲得具有抗腫瘤活性可口服的83. 50kg MPHB。實施例三稱取Ikg酯化度為70 %的柚(Citrus grandis)皮果膠加入50L水，混合，加熱至90°C，保持他，溶脹；冷卻至50°C，向同一容器內(nèi)用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5，加入果膠酯酶，攪拌均勻。經(jīng)測定，果膠酯化度降低到10%時，升溫至85°C保持90min。向同一容器內(nèi)加入果膠裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的混合液，經(jīng)酶降解，使產(chǎn)物主要組分峰均分子量在 20000Da左右。采用MWCO 80000Da的膜，分離除去高分子量果膠和酶；采用MWCO 20000Da 的膜濃縮果膠溶液，產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥，獲得具有抗腫瘤活性可口服的0. 68kg MPHB。實施例四為了篩選與驗證MPHB的抗腫瘤活性，進(jìn)行如下實驗(一)、抗肝癌測試取昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18 22g。小鼠肝癌H22細(xì)胞由小鼠腹腔內(nèi)接種連續(xù)傳代。無菌抽取接種后第7天的吐2小鼠的腹水，用無菌生理鹽水按1 3稀釋后，制成細(xì)胞懸液(腫瘤細(xì)胞數(shù)為么日父^^個/??！^，每只小鼠左腋下接種化〗!^。接種后 50只小鼠隨機(jī)分5組，分別為生理鹽水對照組(NS組)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺，CY, 30mg/ kg)、MPHB高劑量(%ig/kg)、中劑量(ang/kg)、低劑量(lmg/kg)組，小鼠自由進(jìn)食，飲水，活動。接種24h后MPHB給藥組灌胃(ig)給藥，連續(xù)給藥7d，CY組試驗期間腹腔注射兩次，隔日給藥。期間，每日觀察小鼠的一般活動、皮毛、糞便等情況。最后一次給藥24h后，斷頸處死動物，稱量瘤重并計算抑瘤率。若試驗期間陰性組動物腫瘤平均重量小于Ig或20 %的鼠瘤重小于400mg，表示腫瘤生長不良。治療期間試驗組動物死亡超過20%或平均體重下降大于15%者，表示藥物毒性。根據(jù)《抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選規(guī)程》，若試驗組抑瘤率大于30%，可認(rèn)為該藥物具有體內(nèi)抗腫瘤作用。試驗期間各組小鼠食水、毛色、活動狀態(tài)止常。小鼠接種H22細(xì)胞后3天，各組均可觸及皮下腫瘤，試驗期間MPHB各給藥組小鼠活動狀態(tài)止常。第8天處死動物，解剖時發(fā)現(xiàn)， 與NS組比較，MPHB組腫瘤浸潤范圍較小、深度局限、瘤體易剝離。MPHB組各劑量組小鼠體重與NS組比較無明顯差異，CY組小鼠體重較NS組低，進(jìn)一步表明MPHB不具有毒性。MPHB 對吐2荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用見表1。試驗結(jié)果表明MPHB對腫瘤生長的抑制作用基本呈劑量依賴關(guān)系。MPHB高劑量組(％ig/kg)腫瘤重量明顯低于NS組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ < 0.01)，與NS組比較，抑瘤率為47.8% (> 30% )，表明MPHB在高劑量(％ig/kg)下，對肝癌氏2細(xì)胞具有抑制作用。MPHB中劑量Qmg/kg)及低劑量組(lmg/kg)的抑瘤率均低于 30%。表1 MPHB對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用(n = 10)Tab. IThe anti-tumor effect of MPHB against H22 cell line in vivo
權(quán)利要求
1.一種制備具有抗腫瘤活性高生物利用度改性果膠(以下簡稱MPHB)的新工藝，其特征在于包括如下步驟(1)在1份果膠中加入10 1000份水，混合，加熱至60 95°C，溶脹3 12小時；(2)冷卻至45 55°C，在同一容器內(nèi)用碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)pH至4. 5 8. 5 之間，加入果膠酯酶(EC 3. 1. 1. 11)，攪拌均勻。待容器內(nèi)果膠酯化度降低到0.4%至10% 范圍內(nèi)，提高溫度至80 90°C，保持30-90分鐘；( 上述溶液冷卻至40 55°C，向同一容器內(nèi)加入聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. 1. 15)、果膠裂解酶(EC 4. 2. 2. 10)和鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2. 1.X)中的任意一種，產(chǎn)物經(jīng)膜過濾、脫鹽、濃縮與于燥獲得改性果膠MPHB。
2.權(quán)利要求1所述的膜過濾，其特征在于所述的膜為超濾膜，采用錯流過濾模式，首先以截流分子量在^OOOODa到70000Da之間的第一組膜過濾，操作壓力維持在0. 08-0. 30MPa 之間；濾出液采用截流分子量在70000Da到IOOOODa之間的第二組膜過濾，操作壓力維持在 0. 06-0. 20MPa 之間。
3.權(quán)利要求1所述的脫鹽，其特征在于使用超濾膜或納濾膜濾除小分子部分，膜的截流分子量在2000Da 200Da之間。
4.權(quán)利要求1所述的干燥是指噴霧干燥、微波干燥、冷凍干燥工藝中的至少一種。
5.權(quán)利要求1所述的MPHB，其結(jié)構(gòu)特征在于含有同聚半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖半乳糖醛酸-I (RG-I)組成的骨架和含有末端半乳糖殘基的分支，分子量不大于70000Da且不小于2000Da，酯化度介于0. 4%至10%之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述工藝制備的MPHB，可在口服配方中添加腸吸收促進(jìn)劑，其特征在于在口服配方中至少包含中鏈脂肪酸鹽、膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、殼聚糖及其衍生物、卡波姆、十二烷基麥芽糖苷中的一種成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多糖的制備工藝及應(yīng)用，尤其涉及一種高生物利用度、低分子量改性果膠(MPHB)的制備工藝及其在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。所公開工藝包括如下步驟將果膠與水混合，加熱，溶脹；冷卻，用碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)pH，以果膠酯酶(EC 3.1.1.11)降低酯化度，提高溫度滅活酶；冷卻，以聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)或果膠裂解酶(EC 4.2.2.10)降解果膠主鏈，產(chǎn)物經(jīng)膜過濾、脫鹽、濃縮與干燥獲得MPHB。本發(fā)明所述工藝?yán)谝?guī)?；苽銶PHB，利于控制其分子量與分子量分布。MPHB具有抗肝癌、宮頸癌等活性，在其口服配方中添加腸吸收促進(jìn)劑，利于進(jìn)一步提高生物利用度。
文檔編號A61P35/00GK102277398SQ20111020038
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者張文博, 徐萍, 閆清華, 高林 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院