專利名稱：Tf抗原及其類似物、和其化學酶法合成方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于糖類藥物領域，涉及糖類物質的化學酶合成方法，尤其涉及腫瘤相關糖抗原及其類似物的化學酶法合成方法，還涉及所合成TF抗原和sT抗原及其類似物在藥物研發(fā)領域的應用。
背景技術：
目前研究表明，在不同腫瘤組織的產(chǎn)生和發(fā)展過程中存在一種共有現(xiàn)象，即在腫瘤細胞表面會過度表達異常的糖鏈結構，這些糖鏈結構被稱為腫瘤相關糖抗原(TACAs)。同一腫瘤組織會表達不同腫瘤相關糖抗原，同一腫瘤相關糖抗原也會分布于不同腫瘤組織。這些腫瘤相關糖抗原與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后都存在密切關聯(lián)(D.H.Dube and C.R. Bertozzi, Nat. Rev. Drug Discov.，2005，4，477-488. ;M. M. Fuster and J. D. Eskoj Nat.Rev. Cancer.，2005, 5，526-542)。以下是一些常見腫瘤相關糖抗原的結構。
H°V^H( H/0H C0HHOvA9H °f /°H/NHAc HO .OHOH H C0o
。故。兵。R替。
OH HO Sh I NHAcOH HO OH J S3HHO^OH
Sialyi Lewis x (sLex)siai^1 Lewis a (sLeS) fT^OHTnTF
H00HHO0h
OHr*Q -HO、「-]OH^rv .HOr^OH
sTnAcHNor°^OHSiaiyl TF (sTF)
Polysialic acid (PSA) HO 廣OH HO^OH OH.OH
HqvJ^ oh 9°2 Ph Ph
個 J 細 0LohnH
H (0H H0%H Im^ °H GIObOH
HO .OH ,0H HO oh°HOH
J AcHN FucosyiQM1
Tfflm-2^±qh^qJ oh oh
HO0h^OH
HO^ OHLewis Y |sLeY)常見腫瘤相關糖抗原鑒于上述情況，腫瘤相關糖抗原被廣泛的應用于抗腫瘤疫苗的研發(fā)并取得了長足的進展。目前已有多個藥物進入臨床研究階段并表現(xiàn)出了較好的藥效活性(Astixmomo，R.
D., Burton, D. R. , Nat. Rev. Drug Discov.，2010，9，308-324)。但是，目前應用的多數(shù)是天然結構的腫瘤相關糖抗原。由于正常組織本身也會少量表達這些異常糖鏈結構，致使抗腫瘤疫苗的研發(fā)存在以下兩方面的挑戰(zhàn)一，機體免疫系統(tǒng)不能夠對其產(chǎn)生足夠強的免疫應答；二，天然糖抗原會在生理條件下降解使得不能產(chǎn)生特異性的免疫反應(Z.W. Guo andQ. L. Wang, Curr. Opin. Chem. Biol. , 2009, 13, 608-617)。面臨上述兩個挑戰(zhàn)，科學家們將目光聚焦在了對糖鏈結構進行非天然修飾上。如對腫瘤相關糖抗原進行氟代，生成硫苷、碳苷來替換天然的氧苷鍵等一系列方法被用于抗腫瘤疫苗的研發(fā)(Y. Cheng, A. L. Guo and D. S. Guo, Curr. Org. Chem. , 2010, 14, 977-999; X.J. Yuan and R. J. Linhardt, Cur. Top. Med. Chem. , 2005, 5, 1393-1430 ; K. Pachamuthu andR. R. Schmidt, Chem. Rev.，2006, 106，160-187)。這一解決途徑雖然取得成效，但是同時也帶來了合成上的挑戰(zhàn)。由上述腫瘤相關糖抗原的常見結構及近年來的研究可知腫瘤相關糖抗原末端往往有唾液酸化修飾，并且過度唾液酸化也是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中細胞表面糖鏈結構異常的特征之一(Ajit. Varki, Glycobiology, 1993，3，2，97-130),而化學唾液酸化目前仍然是糖化學合成中的一個難點。T-抗原不僅是表達量最高的腫瘤相關糖抗原之一，也在多種腫瘤相關糖蛋白共有成分中表現(xiàn)出極高的過量表達，比如在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌過度表達量近乎 90% (ff. M. Lin, U. Karsten, S. Goletz, R. C. Cheng and Y. Cao, Int. J Exp.Pathol. , 2011, 92, 97-105 ；S. E. Baldus, K. Engelmann and F. G. Hanisch, Crit. Rev.Cl. Lab. Sci., 2004, 41, 189-231)。近來，含有單氟代和雙氟代取代的T-抗原的MUCI糖蛋白類似物得以合成并在動物試驗中表現(xiàn)出了強的免疫原性(M. Johannes, T.Oberbillig and A. Hoffmann-Roder, Org. Biomol. Chem. , 2011, 9, 5541-5546;S.Wagner,
C.Mersch and A.Hoffmann-Roder, Chem-Eur. J. , 2010, 16, 7319-7330;C. Mersch, S. Wagner and A.Hoffmann-Roder,Synlet.t, 2009, 2167-2171;A. Hoffmann-Roder andM. Johannesy, Chem. Comm. , 2011, 47, 9903-9905 ；T. Oberbi 11 ig, C. Mersch, S. Wagner andA. Hoffmann-Roder, Chem. Comm. , 2012, 48, 1487-1489)。且有研究表明化合物的氟代會增強藥物的穩(wěn)定性和生物利用度(J. Xue, V. Kumar, S. D. Khaja, E. V. Chandrasekaran, R.
D.Locke and K. L. Matta, Tetrahedron, 2009, 65, 8325-8335; J. Xia, J. Xue, R. D. Locke, E.V. Chandrasekaran, T. Srikrishnan and K. L. Matta, J. Org. Chem. , 2006, 71, 3696-3706)。而目前限制T-抗原及其類似物和sT-抗原及其類似物的研究與應用的最大屏障是高效快捷的化合物獲取。雖然近年來，化學糖苷化獲得了快速的進展；但依然沒有一個統(tǒng)一有效地普適性方法。由于T-抗原中含有1-3半乳糖苷鍵，化學法合成需要進行反復的保護與脫保護操作并且收率較低、立體選擇性不高(H. Yu, V. Thon, K. Lau, L. Cai, Y. Chen, S. Mu, Y. Li, P. G. Wangand X. Chen, Chem. Comm.，2010，46，7507-7509)。而非天然的修飾又進一步加大了化學法合成上的難度。而目前通過糖基轉移酶來催化的酶法合卻又面臨以下幾方面的困難一是反應往往需要價格昂貴的活性糖為中間體，二是反應的催化往往需要多酶體系，而相應酶的獲得又比較困難；三是該系列酶往往有較強的底物專一性，底物適用性窄難以耐受非天然的修飾。sT-抗原中含有末端唾液酸化修飾。而九碳糖唾液酸由于其自身獨特結構，不僅容易形成分子內(nèi)氫鍵，且在Cl位的羧基、C3位的脫氧、C7位的氮雜原子取代均降低了糖環(huán)上的電子密度，使得唾液酸糖苷鍵的生成成為糖合成領域的經(jīng)典挑戰(zhàn)(Xi Chen. ,AjitVarki.，ACS Chem. Biol.，2010，5，2，163 - 176)。因此，尋找一種快速、高效合成腫瘤相關糖抗原的合成方法是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種TF抗原及其類似物，它它們的化學酶法合成方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案
通式III所示的TF抗原及其類似物或通式IV所示的唾液酸化TF抗原及其類似物通式11權利要求
1.通式III所示的TF抗原及其類似物或通式IV所示的唾液酸化TF抗原及其類似物 其中 R1，選自氫原子、a-或￠-構型絲氨酸殘基、a-或￠-構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、塊基取代燒基、疏基取代燒基、Ct -或|3 -構型取代燒基； R2，選自氟原子、氫原子、疊氮、羥基； R3，選自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮疊氮乙酰氨基； R4，選自氟原子、羥基； R5，選自氟原子、羥基； R6，選自氟原子、羥基； R7，選自氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基、疊氮； R8，選自氟原子、羥基、疊氮。
2.—種權利要求I所述的TF抗原及其類似物的化學酶法合成方法，其特征是，包括以下步驟 (1)選用通式I所示的氟代半乳糖胺類似物或半乳糖胺類似物； 其中 R1，選自氫原子、a-或￠-構型絲氨酸殘基、a-或￠-構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、塊基取代燒基、疏基取代燒基、Ct -或-構型取代燒基； R2，選自氟原子、氫原子、疊氮、羥基； R3，選自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮疊氮乙酰氨基； 和選用通式II所示的氟代半乳糖或半乳糖其中 R4，選自氟原子、羥基； R5，選自氟原子、羥基； R6，選自氟原子、羥基； (2)利用一鍋雙酶法將通式I和通式II所示的化合物立體選擇性偶聯(lián)合成TF抗原及其類似物，所述一鍋雙酶法中先后用到的酶分別為半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；通式III所示的TF抗原及其類似物
3.如權利要求2所述的合成方法，其特征是，步驟(I)中的氟代半乳糖胺類似物采用以下方法合成將半乳糖氨基鹽酸鹽與醋酐進行反應后，將其C-3，C-4位用2，2- 二甲氧基丙烷在樟腦磺酸催化下進行丙酮叉保護；將僅裸露6-位羥基的氮取代氨基半乳糖苷在微波條件下進行氟代，脫保護后即得。
4.如權利要求2所述的合成方法，其特征是，步驟(I)中的氟代半乳糖采用以下方法合成先將半乳糖的1，2-和3，4-位在丙酮中用濃硫酸催化進行丙酮叉保護，再在微波條件下進行氟代，脫保護后即得。
5.如權利要求2所述的合成方法，其特征是，步驟(2)中的TF抗原及其類似物合成方法是:將0. 5-20當量的化合物I、l. 0-10. 0當量化合物II、0. 5-20當量ATP、5_100mMMgCl2、10-500mM, pH 5. 0-10. 0的Tris-HCl緩沖液配制水溶液，然后添加半乳糖激酶；反應完成后，將反應體系的PH值調節(jié)至4. 5-8. 5并加入己糖磷酸化酶；待反應完成后，純化即可直接獲得TF抗原及其類似物。
6.如權利要求2所述的合成方法，其特征是，步驟(3)中的唾液酸化TF抗原及其類似物的合成方法將I. 0-10. 0當量的化合物III、0. 5-20. 0當量的唾液酸及其類似物、0.5-20. 0 當量的 CTP,5. O-IOOmM 的 MgCl2 和 10-500mM, pH 5. 0-10. 5 的 Tris-HCl 緩沖液配制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶和唾液酸轉移酶，實現(xiàn)一鍋雙酶法唾液酸化；反應完成后，純化即可直接獲得唾液酸化TF抗原及其類似物。
7.如權利要求5所述的合成方法，其特征是，所述一鍋雙酶法中先后用到的酶分別是E. coli K-12 galactokinase (GalK)和 Bifidobacterium infantis D-galactosyl-旦 1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反應時間為 25 分鐘-35 小時。
8.如權利要求6所述的合成方法，其特征是，所述一鍋雙酶法唾液酸化中用到的酶是 Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurellamultocida sialyl transferase I (PmSTl)，反應時間為 5 分鐘-30 小時。
9.如權利要求2所述的合成方法，其特征是，所述的酶法合成中反應溫度為0-37°C，轉速為0-240rpm ;所述酶反應的停止方法是向反應中加入等體積的4°C無水乙醇并在4°C下培育0-30分鐘。
10.權利要求I所述的通式III或通式IV在制備抗腫瘤疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種TF抗原及其類似物、和其化學酶法合成方法及其應用，方法包含下列步驟(1)化學合成氟代半乳糖及氟代半乳糖胺類似物；(2)酶法合成氟代TF抗原；(3)酶法合成唾液酸化Thomsen-Friedenreich抗原。本發(fā)明將化學合成法的靈活性和酶合成法的高區(qū)域選擇性和高效性結合到一起，首次實現(xiàn)了氟代TF-抗原的酶法合成，解決了目前化學合成氟代TF抗原中所面臨的底物反應活性低、合成步驟繁多、收率低等不足。由于氟代腫瘤相關糖抗原具有比天然糖抗原更優(yōu)越的藥代性質，因而，本發(fā)明的在發(fā)展新型抗腫瘤疫苗具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61K39/385GK102796144SQ201210300710
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權日2012年8月22日
發(fā)明者曹鴻志, 王鳳山, 閆俊 申請人:山東大學