專利名稱：治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑。
背景技術(shù)：
鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物具有廣泛的耐藥性，這使得鮑曼不動桿菌的治療變得日益困難。碳青霉烯類抗生素被認為是目前臨床治療鮑曼不動桿菌感染最有效的藥物之一。近年來感染耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌比例逐年增高，一旦細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，則對其他抗生素亦基本耐藥，患者往往死于無藥可 選。研究者將抗感染治療的目光開始轉(zhuǎn)向噬菌體的研究。噬菌體是一類細菌依賴性病毒，又稱細菌病毒，能在菌體內(nèi)快速增殖并最終裂解細菌從而達到抗菌作用。但是，活噬菌體制劑治療細菌感染所面臨的最主要障礙是宿主專一性太強，宿主譜太窄。自然分離的噬菌體具有高度專一的宿主選擇性，往往只能感染單一的細菌分離株，而不能感染同一種細菌的其他分離株。這種高度專一的宿主選擇性使噬菌體的應(yīng)用受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種耐藥率低，殺菌譜寬的治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑，其關(guān)鍵是所述生物試劑為噬菌體AB3裂解酶的蛋白質(zhì)溶液，該噬菌體AB3裂解酶的蛋白質(zhì)序列為MILTKDGFGI IRNELFGGKLDQNQVDAINFI IEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPY I GYGYVQLTffKDNYER I GKL I G I DLVKNPEKALEPL I A I Q I A I KGMLNGffFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNI INGKDKAELIAKYAI IFERALRSL SEQ NOl ；所述合成噬菌體AB3裂解酶的基因序列為5， -ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’ SEQ N02。來源于噬菌體AB3的裂解酶為治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿感染提供了另一種途徑。噬菌體AB3的裂解酶水解細菌肽聚糖破壞細胞壁以釋放子代噬菌體，作為潛在的新型殺菌物質(zhì)，具有活噬菌體制劑和抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)勢，細菌對噬菌體裂解酶產(chǎn)生耐藥性的幾率小于抗生素，噬菌體AB3裂解酶的殺菌譜比噬菌體相對較寬。一種噬菌體AB3裂解酶的制備方法，按照如下步驟完成A、噬菌體AB3的分離與純化取醫(yī)院污水適量，將處于早期對數(shù)生長期的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌懸液和B50ml加入到污水中37°C 24h。離心后過濾除菌。10 μ I處理后的污水與200 μ I宿主菌混合20min后，與2ml頂層瓊脂混勻鋪板。單個噬斑經(jīng)過5次反復(fù)純化后即可得到均一的噬菌體；B、提取噬菌體AB3的DNA (I)挑單個細菌菌落接種于200mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)6h，至早期對數(shù)生長期；(2)挑噬菌體AB3單個噬斑分別接種到對應(yīng)宿主菌懸液中，37°C振蕩培養(yǎng)16h ；(3)培養(yǎng)物加 DNase I 及 RNase A 至終濃度各 I μ g/m，37°C X Ih ；(4)按5. 84g/100mL加入NaCl，混勻溶解，冰浴lh，離心IOOOOgX lOmin，收集上清；(5)加入固體PEG8000至終濃度10% (w/v)，充分振蕩溶解，冰浴3h，使噬菌體顆粒形成沉淀，4 離心12000gX IOmin,棄盡上清；(6)用2mLTM液混懸沉淀；(7)加等體積氯仿,振蕩30sec,離心5000gX IOmin,收集上層水相；(8)加 DNase I 至終濃度 5 μ g/m, RNase A 至終濃度 I μ g/mL, 37°C溫育 Ih ； (9)然后加入 EDTA (ρΗ8· O)至終濃度 20mmol/L ；(10)加蛋白酶K至終濃度50 μ g/m，加SDS至終濃度0.5%，混勻，56°C Xlh ；(11)等體積平衡酚(pH8. O)抽提，離心5000gX IOmin,收集上層水相；(12)等體積氯仿再抽提一次，離心5000gX IOmin,收集上層水相；(13)加入1/10體積3mol/L NaAc (pH5. 2)，再加入兩倍體積的無水乙醇沉淀核酸，_20°C過夜，4°C離心12000gX IOmin ;沉淀用70%乙醇和無水乙醇各洗滌一次，去乙醇，空氣中干燥沉淀；(14)用適量TE (pH8. O)混懸沉淀，在核酸定量儀上粗略定量，_20°C保存；C、噬菌體AB3DNA的酶切分析取上述得到的噬菌體核酸溶液，常規(guī)進行酶切。于O. 8%瓊脂糖凝膠中電泳，90V電壓 lh。使用限制性內(nèi)切酶 Hind I.BamH I,EcoR I,Pst I,XbaI,Xho I,BglI,Aat I.DraI、Nhe I、Sac I和Sa I分別消化噬菌體核酸；D、噬菌體AB3衣殼蛋白SDS-PAGE分析；灌注10%分離膠，聚合后再灌注5%積層膠。用5X SDS-PAGE上樣緩沖液混合樣品，100°C IOmin后立即移至冰上冷卻。離心后逐孔加樣，最后將I X SDS-PAGE的上樣緩沖液加入剩余孔。給予8V/cm電壓，待染料前端進入分離膠后，15V/cm電壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍到達分離膠的底部； E、噬菌體AB3裂解酶基因的PCR反應(yīng)擴增；PCR反應(yīng)擴增的引物正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3 ’ SEQN03
反向引物5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04I)試管編號(N) =N=樣本編號數(shù)量+1個陰性對照2) PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑，其特征在于所述生物試劑為噬菌體AB3裂解酶的蛋白質(zhì)溶液，該噬菌體AB3裂解酶的氨基酸序列為MILTKDGFGIIRNELFGGKLDQNQVDAINFIIEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKDNYERIGKLIGIDLVKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL SEQ NOl ;所述合成噬菌體 AB3 裂解酶的基因序列為5’ -ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’ SEQ N02。
2.一種如權(quán)利要求I所述噬菌體AB3裂解酶的制備方法，其特征在于，按照如下步驟完成 A、噬菌體AB3的分離與純化 取醫(yī)院污水適量，將處于早期對數(shù)生長期的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌懸液和LB50ml加入到污水中37°C，24h。離心后過濾除菌。10 μ I處理后的污水與200 μ I宿主菌混合20min后，與2ml頂層瓊脂混勻鋪板。單個噬斑經(jīng)過5次反復(fù)純化后即可得到均勻的噬菌體； B、提取噬菌體AB3的DNA (1)挑單個細菌菌落接種于200mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)6h，至早期對數(shù)生長期； (2)挑噬菌體AB3單個噬斑分別接種到對應(yīng)宿主菌懸液中，37°C振蕩培養(yǎng)16h； (3)培養(yǎng)物加DNaseI及RNase A至終濃度各I μ g/mL, 37 °C X Ih ； (4)按5.84g/100mL加入NaCl，混勻溶解，冰浴lh，離心IOOOOgX lOmin，收集上清； (5)加入固體PEG8000至終濃度10% (w/v)，充分振蕩溶解，冰浴3h，使噬菌體顆粒形成沉淀，4°C離心12000gX IOmin,棄盡上清； (6)用2mLTM液混懸沉淀； (7)加等體積氯仿，振蕩30sec,離心5000gXIOmin,收集上層水相；(8)加DNase I 至終濃度 5 μ g/mL, RNase A 至終濃度 I μ g/mL, 37°C溫育 Ih ； (9)然后加入EDTA(ρΗ8· O)至終濃度20mmol/L ； (10)加蛋白酶K至終濃度SOygAiLjPSDS至終濃度0.5%，混勻，56°C Xlh ； (11)等體積平衡酚(PH8.0)抽提，離心5000gXIOmin，收集上層水相； (12)等體積氯仿再抽提一次,離心5000gXIOmin,收集上層水相； (13)加入1/10體積3mol/LNaAc (pH5. 2)，再加入兩倍體積的無水乙醇沉淀核酸，_20°C過夜，4°C離心12000gX IOmin ;沉淀用70%乙醇和無水乙醇各洗滌一次，去乙醇，空氣中干燥沉淀；(14)用適量TE(pH8.0)混懸沉淀，在核酸定量儀上粗略定量，_20°C保存； C、噬菌體AB3DNA的酶切分析 取上述得到的噬菌體核酸溶液，常規(guī)進行酶切。于O. 8%瓊脂糖凝膠中電泳，90V電壓Ih0 使用限制性內(nèi)切酶 Hind III、BamH I、EcoR I、Pst I, XbaI, Xho I、Bg III、Aat II、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa II分別消化噬菌體核酸； D、噬菌體AB3衣殼蛋白SDS-PAGE分析； 灌注10%分離膠，聚合后再灌注5%積層膠。用5XSDS-PAGE上樣緩沖液混合樣品，IOO0C IOmin后立即移至冰上冷卻。離心后逐孔加樣，最后將I X SDS-PAGE的上樣緩沖液加入剩余孔。給予8V/cm電壓，待染料前端進入分離膠后，15V/cm電壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍到達分離膠的底部； E、噬菌體AB3裂解酶基因的PCR反應(yīng)擴增； PCR反應(yīng)擴增的引物正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3> SEQ N03反向引物5’ -GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04 1)試管編號(N):N=樣本編號數(shù)量+1個陰性對照 2)PCR反應(yīng)體系......在..『以..竹中混介下列液體:ddH2030. Oμ I IOX Rcaclion Buffer5μ I 25mM MgSOI4μ I dNTP Mixture (10 IiM each, final concentration0.2 mM) Iμ 鳥__ Ι)ΝΛ(!()-5(M1W)Iμ I 正向弓丨物(5 pmoi/ μ I final concentration 0.4μ Μ) 4μ I 反['1J')I物(5 pmoI/ μ I f IπηI concentralion 0.4μ Μ) 4μ I Kod plus DNA PoIymerase (III/ρ I)IpI to La I νο I ume50Ii I 3)PCR循環(huán)體系 (I )預(yù)變性 iir2mln (2)變ft9..rC15s (3)IM火 51TC30κ (4)延伸72140s (5)_少驟(2)至步驟(4)$g30循環(huán)_ 4)I. 5%瓊脂糖凝膠檢測 在I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測條帶的是否存在； F、原核表達載體的構(gòu)建；噬菌體AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位點裝入pET28a載體中，在蛋白C端引A6His tag作為親和純化標(biāo)簽。經(jīng)測序驗證正確后，在大腸桿菌中表達； G、噬菌體AB3裂解酶基因的表達及純化； 將噬菌體AB3表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中，第二天挑單克隆到200ml LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 = O. 6，加入ImM IPTG分別于25°C誘導(dǎo)表達20h，37°C誘導(dǎo)表達6h。誘導(dǎo)后，離心收集菌體。PBS溶液懸起菌體，超聲波破碎菌體，4°C冷凍離心，上清部分用Ni柱純化，以含50mM咪唑PBS溶液洗滌雜蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脫。并取樣SDS-PAGE 檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑，其特征在于所述的噬菌體AB3裂解酶基因序列的長度為558bp，噬菌體AB3裂解酶的基因序列全部表達，合成的蛋白質(zhì)長度為185aa。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑，其特征在于所述生物制劑治療的最佳給藥途徑是滴鼻途徑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的噬菌體AB3裂解酶的制備方法，其特征在于所述步驟A中噬菌體濃度的確定采用雙層瓊脂法。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的噬菌體AB3裂解酶的制備方法，其特征在于所述步驟E中所設(shè)計用于PCR反應(yīng)擴增的引物是 正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3> SEQ N03 反向引物5’ -GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04 其中基因序列是SEQ N03的畫線部分為Nco I酶切位點，SEQ N04的畫線部分為Xho I酶切位點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于治療耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的生物試劑。試劑為噬菌體AB3裂解酶的蛋白質(zhì)溶液。制備方法包括噬菌體AB3的分離與純化、噬菌體AB3基因組的提取、噬菌體AB3DNA的酶切分析、噬菌體AB3衣殼蛋白SDS-PAGE分析、噬菌體AB3裂解酶基因的擴增、原核表達載體的構(gòu)建，以及裂解酶基因的表達及純化。這種通過構(gòu)建原核表達載體對噬菌體AB3裂解酶基因表達及純化的方法，可用于臨床上對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染的治療，具有特異性高，見效快等特點，作為新型的抗菌藥物具有獨特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/04GK102861324SQ20121039600
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者張劼, 李秀娟 申請人:重慶市第三人民醫(yī)院