專利名稱：用于制備?？谔阋遫型肽疫苗的多肽及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于制備?？谔阋逴型肽疫苗的多肽，以及含有這些多肽的疫苗及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot and mouth disease,簡稱FMD)是一種偶蹄動(dòng)物發(fā)生的急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布?？谔阋叩膫魅拘愿撸瑐鞑パ杆?，感染豬、牛、羊等牲畜后將導(dǎo)致幼畜死亡，成年動(dòng)物生產(chǎn)能力急劇下降，因此嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和肉食及其畜產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)。目前，口蹄疫使動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的市場流通和國際貿(mào)易受到極大的封鎖和限制，給流行國家和地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？谔阋呤怯煽谔阋卟《?FMDV)感染引起的?？谔阋卟《緦儆诩?xì)小核糖核酸病毒，具有多型性、易變性等特點(diǎn)。目前，已知全世界有7種血清型的口蹄疫病毒:A、O、C、Satl(南非I型)、Sat2 (南非II型)、Sat3 (南非III型)和Asia I (亞洲I型)。這些主型中的每一種又分若干亞型，目前發(fā)現(xiàn)的亞型已有70多種。血清型A、0、C和Asia I型的口蹄疫病毒最為常見，其中血清型A病毒的變種最多，具有超過30種亞型。研究結(jié)果表明，口蹄疫病毒的衣殼蛋白是由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4 (Logan D等，1993年)組成的，每種各60個(gè)。VP1-VP3組成衣殼蛋白亞單位，位于衣殼蛋白的外側(cè)，而VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部。VPl是主要的保護(hù)性抗原，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)O型口蹄疫有3個(gè)主要的抗原位點(diǎn)位于VPl上，其中133-160和200-213位構(gòu)成了 VPl上最重要且最容易變異的保護(hù)性抗原位點(diǎn)?？谔阋卟《靖餍椭g的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫。而且，在同一種血清型中抗原差異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對同一血清型中的另一種亞型沒有保護(hù)性。此外，口蹄疫毒株的抗原性還在不斷發(fā)生變化，隨著時(shí)間的推移，原有疫苗的效力減弱甚至消失，因此給口蹄疫的防治工作帶來了很大的困難。
`
當(dāng)前在我國牛群中流行的口蹄疫主要是O型、ASIA I型和A型口蹄疫。我國對口蹄疫實(shí)行強(qiáng)制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我國現(xiàn)行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒滅活疫苗，其存在著生物安全性差、副反應(yīng)大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。相比之下，目前世界上很多國家已經(jīng)停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國家進(jìn)口畜產(chǎn)品。由此可見，在口蹄疫防治方面，我國已落后于世界發(fā)展形勢。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亞單位疫苗、口蹄疫病毒載體疫苗、口蹄疫基因工程修飾疫苗的研究報(bào)道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在著諸多問題，影響了這些新型疫苗的使用。此外，這些疫苗對于當(dāng)前已經(jīng)發(fā)生變異的流行毒株往往效果較差，不能有效地保護(hù)動(dòng)物。因此，本領(lǐng)域仍然存在對于安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備?？谔阋逴型合成肽疫苗的多肽，以及含有該多肽的疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述多肽以及疫苗的制備方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供上述多肽以及疫苗的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一方面，本發(fā)明提供一種用于制備?？谔阋逴型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。此序列為口蹄疫O病毒的核心B細(xì)胞表位序列，負(fù)責(zé)產(chǎn)生針對口蹄疫病毒的中和抗體。SEQ ID N0.1:YNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK本發(fā)明中提及的“多肽”和“合成肽”為同一概念，均是指通過固相有機(jī)合成得到的肽物質(zhì)。優(yōu)選地，所述多肽還包含具有增強(qiáng)免疫作用的口蹄疫內(nèi)源或外源性T細(xì)胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列選自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4中的一個(gè)或多個(gè)。在本發(fā)明中，由計(jì)算機(jī)預(yù)測口蹄疫O病毒的T細(xì)胞表位，然后利用軟件設(shè)計(jì)新的T細(xì)胞表位肽，再通過體外評價(jià)動(dòng)物細(xì)胞免疫水平，由此篩選得到上述氨基酸序列的多肽，其能夠輔助B細(xì)胞表位產(chǎn)生中和抗體。SEQ ID N0.2:AGLAGVMVTESVAFRKKVSEQ ID N0.3: VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELKVSEQ ID N0.4:SPGQVVYNRPHNSAYKV進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多肽包含如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列。SEQ ID N0.5:AGLAGVMVTESVAFRKKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIKSEQ ID N0.6:VAQHNLSTEAIPLVVHESLMIVAQSIAGELKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIKSEQ ID N0.7:SPGQVVYNRPHNSAYKVYNGNCKYGENAVTNVRGDLQVLAQKAARCLPTSFNYGAIK根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6 或 SEQ ID N0.7 所示；優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列中的兩個(gè)半胱氨酸的巰基可以經(jīng)氧化連接在一起形成~■硫鍵；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間可以反應(yīng)形成共價(jià)連接。其中本文提供的序列是從N端到C端，也就是N端和C端的殘基反應(yīng)形成連接。具體而言，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
本發(fā)明提供的上述多肽可以直接向商業(yè)肽合成公司定制獲得，或者采用可商購的自動(dòng)合成儀、根據(jù)制造商的操作規(guī)程合成。另一方面，本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:(I)以氨基樹脂為起始原料，以由9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸以合成所述多肽，每步縮合反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的氣基端；(2)合成完畢后加入裂解試劑，從而將所述多肽從氨基樹脂上裂解下來；(3)使用乙醚沉淀所述多肽；和(4)對所述多肽進(jìn)行超濾純化，然后進(jìn)行無菌處理。在上述制備方法中，所 述步驟(I)具體包括以下步驟:(Ι-a)脫保護(hù)反應(yīng):將氨基樹脂置于體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘，從而脫除氨基樹脂上的9-芴甲
氧羰基保護(hù)基團(tuán)；(Ι-b)洗滌:氮?dú)獯蹈?，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；(Ι-c)縮合反應(yīng):加入1-羥基苯丙三唑(Η0ΒΤ)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與由
9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸，然后在20-28°C條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)；(Ι-d)洗滌:氮?dú)獯蹈?，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；和(Ι-e)封閉反應(yīng):加入重量體積百分比為1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28°C條件下反應(yīng)20-40分鐘。在上述制備方法中，所述步驟(2)中裂解試劑的組分為體積比為85:8:6:1的三氟乙酸:三異丙基硅烷:苯酚=H2O ;并且，所述步驟(2)的裂解時(shí)間為1-4小時(shí)。在上述制備方法中，所述步驟(3)具體包括:(3-a)使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗滌；(3-b)在加入占反應(yīng)體系總體積10%的二甲基亞砜(DMSO)情況下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵；和(3-c)使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接；優(yōu)選地，在加入占反應(yīng)體系總體積1%的二異丙基碳二亞胺(DIC)和0.5%的1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)情況下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者在加入0.1M H2SO4情況下使羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。在上述制備方法中，所述步驟(4)具體包括以下步驟:(4-a)使用切向過濾膜包在20_28°C條件下超濾所述多肽，從而除去小分子雜質(zhì)；和(4-b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。又一方面，本發(fā)明提供了一種肽疫苗，所述肽疫苗包含一種或多種上述多肽。并且，所述肽疫苗優(yōu)選還包含佐劑；優(yōu)選地，所述佐劑為選自白油、50V、50VII中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐劑的體積比為1:1。再一方面，本發(fā)明提供了該肽疫苗的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:(I)用注射用水將所述多肽稀釋為50 μ g/ml的濃度，從而得到多肽抗原水相；(2)將佐劑在121°C條件下滅菌30分鐘；和
(3)在20_28°C條件下，按照所述多肽抗原水相與所述佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，在90-150轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌1.5-3分鐘，然后緩慢加入多肽抗原水相，攪拌20-30分鐘，再在8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝。
還一方面，本發(fā)明提供了上述多肽或肽疫苗在制備用于預(yù)防牛口蹄疫O型的藥物中的用途。具體而言，本發(fā)明人通過對國內(nèi)口蹄疫新近流行毒株的序列測定并結(jié)合口蹄疫疫苗毒株序列，研究口蹄疫主要抗原位點(diǎn)的變異情況，針對主要變異的氨基酸位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)其變異的頻率，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助進(jìn)行口蹄疫抗原位點(diǎn)的分析預(yù)測，對可能的抗原位點(diǎn)肽段進(jìn)行化學(xué)合成，即針對易變異位點(diǎn)根據(jù)統(tǒng)計(jì)的變異頻率，在這些位點(diǎn)使用不同的氨基酸，得到涵蓋當(dāng)前所有可能變異位點(diǎn)的多種候選多肽抗原。進(jìn)而，通過大量的動(dòng)物試驗(yàn)對這些候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到能夠引起動(dòng)物的免疫反應(yīng)，而且免疫反應(yīng)水平高，能夠很好的保護(hù)動(dòng)物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。此外，本發(fā)明人根據(jù)篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果對口蹄疫病毒抗原位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化，并有效組合了 T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，增強(qiáng)了多肽抗原的免疫效果。肽疫苗效力實(shí)驗(yàn)、安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的?？谔阋逴型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不會(huì)引發(fā)傳統(tǒng)疫苗存在的發(fā)熱、紅腫等問題，因此本發(fā)明的疫苗可以有效應(yīng)對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例1?？谔阋逴型合成肽抗原的固相合成本發(fā)明的合成肽抗原可以使用ABI公司433型全自動(dòng)多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法制備,其中采用了由9-荷甲氧羰基(Fmoc)修飾的氨基酸，固相載體為購自美國Sigma公司的Rink Amide MBHA樹脂。生產(chǎn)過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1.1合成肽抗原的固相合成1.1.1合成原料準(zhǔn)備合成多肽抗原的序列分別如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示。依據(jù)抗原的序列以及Immol的合成規(guī)模，準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸(購自上海吉爾生化),加入相應(yīng)的氨基酸小瓶中。同樣按要求稱量Rink Amide MBHA樹脂，放入反應(yīng)腔中，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱、批號、反應(yīng)腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相對應(yīng)的試劑瓶中。1.1.2合成儀狀態(tài)檢測檢查多肽合成儀是否正常運(yùn)行。開機(jī)后，運(yùn)行Run Self Test程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查N2是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進(jìn)行測定。發(fā)送Flow Ratel-18到合成儀，選擇MainMenu—Module Test一按 Prer 或 next 找 ModuleA、ModuleD、Module1、Module1、ModuleA—按Start—按more進(jìn)行測量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力，直至達(dá)到要求。1.1.3合成肽抗原的合成開始在合成儀的程序中將合成需要的方法Std Fmoc 1.0 Sol DIC90發(fā)送到合成儀上。File-New-Sequence-編輯合成妝的序列，保存。File-New-Run,檢查 Chemistry ；Sequence是否為所存名字；設(shè)定Cycles ;保存。最后發(fā)送到合成儀上。Main Menu—Cycle Monitor—begin,開始運(yùn)行。1.1.4合成肽抗原的合成如上述的多肽序列，合成的時(shí)候是從C端開始至N端，依照給定的順序，依次不斷地重復(fù)如下合成步驟:(I)脫保護(hù)反應(yīng):將上述氨基樹脂置于體積百分比為15%_30%的六氫吡啶的NMP溶液中，在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘脫除氨基樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；(2)洗滌:氮?dú)獯蹈?，NMP洗滌氨基樹脂；(3 )縮合反應(yīng):加入Η0ΒΤ、DCC與Fmoc保護(hù)的氨基酸在20_28 °C條件下反應(yīng)
0.5-2.5 小時(shí)；(4 )洗滌:氮?dú)獯蹈?，NMP洗滌氨基樹脂；

(5)封閉反應(yīng):加入重量體積百分比為1.5%_4%的乙酰咪唑的NMP溶液，在20-28 °C條件下反應(yīng)20-40分鐘。1.1.5合成肽抗原合成結(jié)束抗原合成結(jié)束后合成儀將自動(dòng)停止。然后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用100%甲醇洗滌多肽樹脂3次，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，將多肽樹脂轉(zhuǎn)移至棕色瓶內(nèi)，放入-20°C冰箱內(nèi)，封口膜密封備用。1.2合成肽抗原的裂解及鑒定1.2.1合成肽抗原的裂解按照體積比例(三氟乙酸(TFA)/三異丙基硅烷(TIS)/苯酚/H20=85/8/6/l)配制裂解液，然后從冰箱內(nèi)取出合成的多肽樹脂，放入圓底燒瓶內(nèi)，在通風(fēng)櫥內(nèi)向燒瓶內(nèi)加入配制好的裂解液和磁攪拌子，然后穩(wěn)定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌I小時(shí)直至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)30至120分鐘除去粗產(chǎn)品中的TFA。接著使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂芯漏斗過濾出來，即得到多肽抗原。1.2.2合成肽抗原的鑒定多肽抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行定性定量分析。1.3合成肽抗原的構(gòu)象形成用15% DMSO將多肽抗原配制成濃度為2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或
0.1N HCl調(diào)整初步分離多肽溶液的pH值=8.5，在25°C的環(huán)境下在轉(zhuǎn)速為IlOrpm的搖床上放置48小時(shí)，使形成二硫鍵。
進(jìn)而進(jìn)行首尾環(huán)化，首尾氨基酸的“ -COOH ”與“ -NH2 ”環(huán)化方法參見Mengfen等Peptide Protein Reserch 1996.48:229-239 ;使首尾氨基酸的“-C00H” 與“-0H”進(jìn)行反應(yīng)而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的方法參見Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92:3771-3777。由此得到能夠模擬病毒粒子天然構(gòu)象的多肽環(huán)化結(jié)構(gòu)。1.4合成肽抗原的純化除菌合成肽抗原使用循環(huán)式切向過濾膜包在20-28°C條件下進(jìn)行超濾(TangentialFlow Device循環(huán)式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動(dòng)泵)，多肽抗原是大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及后期環(huán)化反應(yīng)形成或引進(jìn)的小分子雜質(zhì)則可以通過濾膜。然后再通過孔徑為0.2μπι在線過濾器除菌，將最后得到的溶液分裝到無菌塑料瓶內(nèi)，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件，分裝后，儲存于-20 V或-40 V備用。為了便于運(yùn)輸和長期保存的需要，將多肽抗原進(jìn)行冷凍干燥以得到固體狀態(tài)的多肽。將預(yù)先凍好的多肽抗原取出，在Labconco冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥，得到固體狀態(tài)的多肽抗原。同時(shí)貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件。實(shí)施例2合成肽疫苗的配制2.1抗原水相的配制分別稱取依照實(shí)施例1制備的序列分別如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.7所示的合成肽抗原，然后用滅菌注射用水將合成肽抗原濃度稀釋至50yg/ml。將所得抗原溶液經(jīng)孔徑為0.2 μ m的過濾器過濾，除菌。2.2油相佐劑制備

將油相佐劑50V經(jīng)121°C滅菌30分鐘，備用。2.3合成肽疫苗的乳化用滅菌的蒸餾水2000ml清洗IKA乳化設(shè)備3次，然后在20_28°C條件下按油相佐劑和抗原水相為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)以90 150r/m慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌2分鐘后，同時(shí)緩慢加入水相抗原,加完后攪拌30分鐘，再以10000r/m高速攪拌20分鐘，靜置5分鐘，使疫苗乳化成油包水的單相疫苗。實(shí)施例3牛口蹄疫O型合成肽疫苗效力試驗(yàn)1.材料與方法1.1合成肽疫苗按照實(shí)施例1制備序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的多肽抗原，然后按照實(shí)施例2分別配制的對應(yīng)批號為:ZM01、ZM02和ZM03的O型口蹄疫合成
肽疫苗。1.2試驗(yàn)動(dòng)物挑選口蹄疫抗體陰性(乳鼠中和抗體滴度< 1: 4)的6月齡健康黃牛37頭(購自蘭州地區(qū)牛場)。1.3 毒種 0S/99用3-4日齡乳鼠測定并調(diào)整毒價(jià)，置于_25°C冷凍保存?zhèn)溆谩?.4試驗(yàn)方法
將3組試驗(yàn)肽疫苗中的每組疫苗分別免疫5頭牛，同時(shí)用常規(guī)滅活疫苗(牛口蹄疫O型二價(jià)滅活疫苗，由中牧股份蘭州生物藥廠提供，批號1112001)作為陽性對照，免疫5頭牛。陰性對照2頭牛。免疫時(shí)采用耳后肌肉注射，注射劑量均為2ml/牛。免疫21天后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點(diǎn)皮內(nèi)注射?？谔阋逴型病毒強(qiáng)毒0S/99，每點(diǎn)0.1ml (共0.2ml，含IOOOOID5q)。攻毒10天后，觀察記錄試驗(yàn)結(jié)果。1.5結(jié)果判定對照牛均應(yīng)至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍、而其它部位無病變時(shí)判為保護(hù)，除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍時(shí)判為不保護(hù)。2.試驗(yàn)結(jié)果與討論2.1試驗(yàn)結(jié)果免疫21天后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點(diǎn)皮內(nèi)注射牛口蹄疫O型病毒強(qiáng)毒0S/99，每點(diǎn)0.1ml (共0.2ml，含10000ID5(i)。攻毒10天后，結(jié)果詳見表I。表I?？谔阋逴型合成肽疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于制備?？谔阋逴型肽疫苗的多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽還包含具有增強(qiáng)免疫作用的口蹄疫內(nèi)源或外源性T細(xì)胞表位氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列選自SEQ ID N0.2、SEQID N0.3和SEQ ID N0.4中的一個(gè)或多個(gè)； 優(yōu)選地，所述多肽包含如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQID N0.5、SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.7 所示； 優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列中的兩個(gè)半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接；更優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (O以氨基樹脂為起始原料，以由9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸以合成所述多肽，每步縮合反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的氨基端; (2)合成完畢后加入裂解試劑，從而將所述多肽從氨基樹脂上裂解下來； (3)使用乙醚沉淀所述多肽；和 (4)對所述多肽進(jìn)行超濾純化，然后進(jìn)行無菌處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)包括以下步驟: (Ι-a)脫保護(hù)反應(yīng):將氨基樹脂置于體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28 °C條件下反應(yīng)25-40分鐘，從而脫除氨基樹脂上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)； (Ι-b)洗滌:氮?dú)獯蹈?，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂； (Ι-c)縮合反應(yīng):加入1-羥基苯丙三唑、二環(huán)己基碳二亞胺與由9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸，然后在20-28°C條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)； (Ι-d)洗滌:氮?dú)獯蹈?，然后用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；和(Ι-e)封閉反應(yīng):加入重量體積百分比為1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28 °C條件下反應(yīng)20-40分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中裂解試劑的組分為體積比為85:8:6:1的三氟乙酸:三異丙基硅烷:苯酚=H2O ； 優(yōu)選地，所述步驟(2)的裂解時(shí)間為1-4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法的步驟(3)中還包括: (3-a)使用乙醚沉淀所述多肽，然后用二甲基甲酰胺洗滌； (3-b)在加入占反應(yīng)體系總體積10%的二甲基亞砜情況下，使沉淀得到的多肽的氨基酸序列中兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵；和(3-c)使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接；優(yōu)選地，在加入占反應(yīng)體系總體積1%的二異丙基碳二亞胺和0.5%的1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑情況下使所述多肽的氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者在加入0.1M H2SO4情況下使羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)包括以下步驟: (4-a)使用切向過濾膜包在20-28°C條件下超濾所述多肽，從而除去小分子雜質(zhì)；和 (4-b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。
9.一種?？谔阋逴型肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽疫苗，其特征在于，所述肽疫苗還包含佐劑； 優(yōu)選地，所述佐劑為選自白油、50V、50VII中的一種或多種； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐劑的體積比為1:1。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的肽疫苗的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)用注射用水將所述多肽稀釋為50μ g/ml的濃度，從而得到多肽抗原水相； (2)將佐劑在121°C條件下滅菌30分鐘；和 (3)在20-28°C條件下，按照所述多肽抗原水相與所述佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，在90-150轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌1.5-3分鐘，然后緩慢加入多肽抗原水相，然后攪拌20-30分鐘，再在8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘下攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽或者根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的肽疫苗在制備用于預(yù)防?？谔阋逴型的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于制備?？谔阋逴型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列以及含有該多肽的肽疫苗。提供的?？谔阋逴型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不會(huì)引發(fā)傳統(tǒng)疫苗存在的發(fā)熱、紅腫等問題，因此本發(fā)明的疫苗可以有效應(yīng)對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供了所述多肽和肽疫苗的制備方法以及其制藥用途。
文檔編號A61K39/135GK103183728SQ201310097949
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者巴利民, 齊鵬, 肖進(jìn), 栗利芳, 宋芳, 董春娜, 趙洪濤, 鄭應(yīng)華, 鄭明舉, 張愛民, 馬愛榮 申請人:中國牧工商(集團(tuán))總公司