專利名稱：重組人muc1-mbp融合蛋白抗腫瘤疫苗及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤生物治療中主動(dòng)特異性免疫的疫苗技術(shù)，尤其是提供了一種重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗及生產(chǎn)工藝，以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤目的，屬于基因工程融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
MUC1是Mucins粘蛋白家族的重要成員，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及其來源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核芯(核芯肽)和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。正常組織MUC1與腫瘤組織不同，前者分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對隔離，糖基化豐富；而后者廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于癌細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)。
目前，以MUC1為靶點(diǎn)的疫苗包括蛋白或多肽疫苗、糖疫苗和DNA疫苗，其中蛋白疫苗表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Livingston研究小組1996年通過合成不同長度的MUC1串聯(lián)重復(fù)序列，將30aa重復(fù)序列與KLH連接，免疫鼠誘導(dǎo)出高效價(jià)的MUC1特異性抗體，盡管未誘導(dǎo)出CTL，但明顯抑制了腫瘤的生長，而單獨(dú)使用多肽免疫不能產(chǎn)生任何免疫應(yīng)答。美國Biomira公司正在研制基于MUC1的多肽疫苗，命名為BLP-25，已進(jìn)入非小細(xì)胞肺癌的臨床II期試驗(yàn)階段。研究發(fā)現(xiàn)單純的多肽不能誘導(dǎo)任何免疫應(yīng)答，只有制備成融合蛋白后，方能不同程度的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。而以往研制的融合蛋白疫苗，多半為人工合成多肽，并且多數(shù)面臨著免疫原性弱不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)等缺點(diǎn)。
麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)是大腸桿菌的成分，由大腸桿菌malE基因編碼，其具有強(qiáng)的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用基因工程的方法，提供一種重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗的生產(chǎn)工藝，制備MUC1-MBP融合蛋白-腫瘤疫苗，是腫瘤生物治療中主動(dòng)特異性免疫的治療方法，以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤目的。
本發(fā)明是將MBP基因與MUC1基因融合在一起，研制一種基因工程融合蛋白疫苗。用MBP代替其他的融合蛋白誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。pMAL-p2是高效表達(dá)麥芽糖融合蛋白的原核表達(dá)載體，我們將MUC1基因的串聯(lián)重復(fù)序列插入malE基因的下游，一方面能在大腸桿菌中直接高效誘導(dǎo)表達(dá)與MBP融合的蛋白，另一方面省卻了化學(xué)合成融合蛋白的步驟。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下1.將該MUC1基因450個(gè)堿基按照正確閱讀框插入pMAL-p2原核表達(dá)載體malE基因下游，使MUC1與MBP基因連接到一起，通過酶切鑒定該重組載體pMAL-MUC1的正確性。(圖1)2.表達(dá)MUC1-MBP融合蛋白的重組質(zhì)粒pMAL-MUC1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在IPTG的誘導(dǎo)下，表達(dá)了分子量62KD的融合蛋白MBP-MUC1，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定其正確性，并得到穩(wěn)定的表達(dá)菌株pMAL-MUC1/DH5α。(圖2，圖3)3、常規(guī)基因測序測定MUC1-MBP融合蛋白的基因序列。
4.大量培養(yǎng)pMAL-MUC1/DH5α，經(jīng)過超聲破碎提取全菌體上清液，通過凝膠過濾層析→淀粉糖親和層析→超濾獲得了較純的MUC1-MBP融合蛋白和MBP蛋白。通過SDS-PAGE得到了鑒定.(Fig.4)5.MUC1-MBP抗腫瘤免疫活性的測定。
(1)抗MUC1特異性抗體的測定將重組MUC1-MBP融合蛋白免疫C57小鼠，通過ELISA檢測多克隆抗體。
(2)抗MUC1特異CTL細(xì)胞毒活性的測定通過MTT法測定CTL細(xì)胞毒殺傷活性。
(4)免疫鼠成瘤實(shí)驗(yàn)將高表達(dá)MUC1的人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)注射給免疫的C57小鼠，3-5周后觀察肺部及局部腫瘤生長情況。
MUC1-MBP融合蛋白核苷酸序列特征長度1710個(gè)堿基類型 核酸鏈性 單鏈1.atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctcggccgat61 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt121 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat181 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt241 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc
301 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac361 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa421 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaa gagatcc cggcgctgga taaagaactg481 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg541 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa601 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt661 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa721 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa781 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttc aagggtc aaccatccaa accgttcgtt841 ggcgtgctga gcgcaggtat taa cgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc901 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg961 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc1021 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc1081 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa1141 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1201 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc ccgggctgca ggaattcccc1261.gcccccccag cccacggagt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1321.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1381.gccccccaag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1441.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1501.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1561.gcccccccac tccacggtgt cacctcggcc ccggagaaca ggccggcccc gggctccacc1621.gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc ccggagagca ggccggaatt cgatatcaag1681.cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tga本發(fā)明適用于下述醫(yī)療用途1.預(yù)防和治療各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌。
2.腫瘤手術(shù)后殘留病灶的治療。
3.BCG作為佐劑增強(qiáng)MUC1-MBP誘導(dǎo)的免疫。
4.與IL-2或GM-CSF配伍使用。
5.與化療藥物配伍使用。
目前腫瘤治療采取綜合療法包括手術(shù)、放療和化療。但面臨著主要問題是殘留病灶，不能徹底根治。隨著對腫瘤的病因?qū)W、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對腫瘤和宿主免疫學(xué)關(guān)系的認(rèn)識(shí)不斷加深，腫瘤生物治療，尤其是以腫瘤抗原為基礎(chǔ)研制的腫瘤疫苗受到普遍關(guān)注，有效的腫瘤疫苗不僅抗腫瘤作用強(qiáng)，而且無放療化療的毒副作用，使解決腫瘤治療中的殘留病灶成為可能。
下述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明藥物制劑具有預(yù)防和治療各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌等作用1.重組MUC1-MBP誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答采用競爭ELISA對抗MUC1特異抗體進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，重組人類MUC1蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗人類MUC1的特異性抗體。PBS對照組及純品MBP組免疫鼠均未見抗MUC1特異抗體，但后者血清中出現(xiàn)高效價(jià)的抗MBP抗體，表明MBP是誘導(dǎo)鼠產(chǎn)生MUC1抗體的有利載體。MUC1-MBP免疫組抗MUC1抗體的效價(jià)為15760±3221。(Fig.5，F(xiàn)ig.6)用重組的MUC1-MBP融合蛋白免疫C57小鼠，產(chǎn)生了高效價(jià)的特異的抗人類MUC1抗體。佐劑BCG明顯增強(qiáng)了抗體反應(yīng)。
2.融合蛋白MUC1-MBP誘導(dǎo)的抗MUC特異的CTL反應(yīng)通過MTT法測定了小鼠脾CTL活性，分別用MCF-7和鼠Lewis肺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，在效靶比例為100∶1時(shí)，BCG組與PBS對照組相比殺傷活性無明顯差別；MUC1-MBP免疫組小鼠脾細(xì)胞對MCF-7細(xì)胞和Lewis肺癌細(xì)胞殺傷活性分別為47.7±4.3％和67.5±6.5％，與PBS對照組及BCG組相比P＜0.01，有顯著性差異；當(dāng)用K562作為靶細(xì)胞時(shí)，MUC1-MBP免疫組、BCG組和PBS對照組小鼠脾細(xì)胞殺傷活性組間比較P.＞0.05，無顯著性差異。該結(jié)果表明，無論對于人類MCF-7還是鼠Lewis肺癌細(xì)胞每只鼠均誘導(dǎo)出MUC1特異的CTL活性，并且殺傷率隨著效靶比例的增高而增加(Fig.7))。該結(jié)果表明重組MUC1-MBP融合蛋白不僅存在B細(xì)胞表位，同時(shí)也存在CTL表位。
用融合蛋白MUC1-MBP免疫C57鼠產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗MUC1特異的CTL，其針對人類MCF7和鼠Lewis肺癌細(xì)胞，均表現(xiàn)出明顯的殺傷活性。由于我們在實(shí)驗(yàn)中使用的材料是脾細(xì)胞，因此所測定的殺傷活性可能包含非特異性殺傷(NK)，為排除這種可能，我們用K562作為對照，MUC1免疫組與PBS對照組相比，對K562的殺傷活性雖然略有增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可排除誘導(dǎo)NK細(xì)胞活性的可能。另外，為排除BCG誘導(dǎo)的非特異性殺傷，我們用BCG單獨(dú)免疫小鼠，測定脾細(xì)胞的殺傷活性也未見增高。上述結(jié)果均證實(shí)MUC1-MBP免疫鼠誘導(dǎo)了MUC1特異的CTL活性。CTL特異性殺傷通常受自身MHC的限制，而經(jīng)MUC1-MBP融合蛋白免疫鼠誘導(dǎo)的CTL能夠殺傷人類乳腺癌細(xì)胞，表明其誘導(dǎo)的殺傷不受MHC限制。
3.MUC1-MBP誘導(dǎo)的主動(dòng)免疫對于人乳腺癌細(xì)胞系(MCF7)生長抑制在荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)中，使用腫瘤細(xì)胞是MCF7做動(dòng)物模型。在用疫苗免疫后的第3-10天給C57小鼠注射MCF7細(xì)胞，三周后，對照組在背部注射局部均長出大小不等的腫瘤，其中體積最大的是2250mm3，有的腫瘤中心破潰；鼠狀態(tài)消瘦，毛色灰暗無光澤，28天后該鼠死亡。對照組腫瘤平均體積537mm3；；而經(jīng)融合蛋白MUC1-MBP免疫鼠，僅有6只在背部長出18-31mm3大小的腫瘤。疫苗免疫組腫瘤平均體積14mm3。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異(p＜0.001)。人類重組MUC1-MBP融合蛋白誘導(dǎo)的免疫明顯抑制了人腺癌細(xì)胞的生長。
表1.MUC1免疫鼠注射MCF7R人乳腺癌的生長腫瘤體積(mm3)NO對照組疫苗免疫組1 1500 182 456 263 502 04 722 315 268 06 151 197 353 248 198 09 821 2710397 0本發(fā)明的積極效果在于本發(fā)明是通過誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答，來達(dá)到抗腫瘤的目的?？朔艘酝诤系鞍滓呙缑庖咴匀醪荒苷T導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)等缺點(diǎn)。本疫苗是利用基因工程的方法在大腸桿菌中制備，成本低廉，適合于商業(yè)化生產(chǎn)。


圖1重組pMAL-MUC1酶切片段的分析。
用BamHI和HindIII消化pMAL-MUC1、pMAL和pBS-MUC1。
第1列pMAL-MUC1，第2列pMAL，第3列pBS-MUC1，第4列DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
圖2重組的MUC1-MBP融合蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達(dá)。
第一列蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，第二列未經(jīng)轉(zhuǎn)化的DH5α，第三列未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pMAL/DH5α，第四列從第4列到第8列分別為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1到5小時(shí)的pMAL/DH5α。第九列未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pMAL-MUC1/DH5α，從第10列到第14列分別為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1到5小時(shí)的pMAL-MUC1/DH5α。
圖3 MUC1-MBP的表達(dá)通過Westemblot的分析。
第一列pMAL-MUC1/DH5α的總蛋白，第二列pMAL-MUC1/DH5α的質(zhì)周腔蛋白，第三列未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pMAL-MUC1/DH5α的總蛋白，第四列pMAL/DH5α的總蛋白。
圖4純化的MUC-MBP通過SDS-PAGE的分析。
第一列蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，第二列純化的MUC1-MBP，第三列純化的MBP。
圖5抗MUC1抗體與MUC1-MBP的反應(yīng)。
首先，將抗血清與過量的MBP反應(yīng)，封閉抗血清中抗MBP抗體與融合蛋白MUC1-MBP反應(yīng)位點(diǎn)，然后再通過ELISA測定抗MUC1抗體。
圖6抗MUC1抗體的效價(jià)分別通過MUC1-MBP(◆)、MBP(▲)、PBS(■)和BCG(●)。注射的C57小鼠血清中抗MUC1抗體的效價(jià)通過競爭ELISA進(jìn)行測定。免疫過程中用BCG作佐劑。
圖7 MUC1-MBP免疫鼠脾臟抗MUC1特異的CTL反應(yīng)。
(●)為MUC1-MBP免疫組，，(◆)為PBS對照組，(■)為BCG對照組。
A是Lewis肺癌作為靶細(xì)胞，B是MCF7作為靶細(xì)胞，C是K562作為靶細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一.MUC1-MBP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建1.常規(guī)質(zhì)粒提取與純化.(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，j。薩姆布魯克，主編科學(xué)出版社出版，1998)2.酶切片段的分離與回收.
(1)用EcoRI和HindIII雙酶切pMAL-P2及PSK-MUC1質(zhì)粒，25-37℃ 1-3小時(shí)。
(2)在0.7-1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA片段，用凍融法或試劑盒回收載體片段pMAL-p2和450bp目的片段MUC1。
(3)在0.7-1.5％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定回收的載體片段及目的片段。
3.pMAL-p2載體與MUC1片段的連接pMAL-p2載體片段1-10μlMUC1片段 5-20μlEcoRI 2-4μlHindIII2-4μlT4連接酶 1-2μl按上述量，在50-100μl反應(yīng)體系中16℃的條件下反應(yīng)一個(gè)晚上.通過T4連接酶將MUC1片段按正確的閱讀框連接到經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的載體片段上，然后取出1-10μl常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
4.常規(guī)制備感受態(tài)(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，j。薩姆布魯克，主編科學(xué)出版社出版，1998)5.大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)在每管250μl的感受態(tài)中加入1-5μl的質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。
(2)42℃休克2分鐘.
(3)冰浴2分鐘..
(4)4℃5000rpm離心10分鐘.
(5)棄上清剩余100μl重懸菌體.鋪于含氨卞青霉素的LB瓊脂平板表面.
(6)37℃恒溫倒置過夜培養(yǎng).
6重組克隆的篩選與鑒定經(jīng)氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落，挑取不同的克隆小量培養(yǎng)，如前所述提取質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII雙酶切質(zhì)粒，然后通過1％的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，通過插入片段的分子量大小確定MUC1片段。
二.MUC1-MBP融合蛋白重組載體(pMAL-MUC1)的表達(dá)與鑒定1重組MUC1基因的誘導(dǎo)表達(dá)(1)將正確連接的pMAL-MUC1載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并將其鋪于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中，25-37℃過夜培養(yǎng).
(2)挑取不同的菌落接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)中，于25-37℃過夜培養(yǎng).
(3)將50μl的每種過夜培養(yǎng)物分別接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，25-37℃通氣培養(yǎng)3-4小時(shí)，以0.1mM-1.0mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3-6小時(shí)，離心沉淀細(xì)菌，棄上清，將沉淀保存于-20℃.
(4)重懸沉淀，然后加入相同體積的載樣液混勻，80-100℃煮沸5分鐘，離心，取上清10-30μl加入到SDS-PAGE上電泳鑒定蛋白的表達(dá)情況.
2.pMAL-MUC1在大腸桿菌中的大量表達(dá)(1)將凍存的pMAL-MUC1/DH5α接種于5-150ml LB培養(yǎng)液中，25-37℃振搖過夜.
(2)次日，將培養(yǎng)物接種于500-2000ml LB培養(yǎng)液中(3)離心沉淀.棄上清，將沉淀保存于-20℃。
(4)加入0.1-1.0mM IPTG繼續(xù)培養(yǎng)3-8小時(shí)。
(5)離心沉淀.棄上清.將沉淀保存于-20℃。
(6)稱取濕菌的重量.-20℃保存.
3.聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)(1)安裝電泳玻璃板裝置，(2)配制5％濃縮膠和10％分離膠，(3)將細(xì)菌沉淀重懸于1×載樣液中，100℃煮沸5分鐘破碎細(xì)菌，(4)安裝電泳槽(5)取上清10-30μl加入10％SDS-PAGE(6)設(shè)恒壓100-200V，電泳1-2h(7)卸下凝膠，考馬斯亮藍(lán)R-250振搖染色1h.
(8)在50％甲醇，7％乙酸，水溶液中脫色1h.
5.Western blot(1)當(dāng)SDS-PAGE電泳即將結(jié)束時(shí)，用蒸餾水沖洗半干式轉(zhuǎn)移槽的石墨板，擦干。
(2)切膠，6張濾紙和一張硝酸纖維素膜，大小相同。用轉(zhuǎn)移液浸泡5分鐘。
(3)安裝轉(zhuǎn)移槽，平放石墨板底座，在石墨板上放置3張經(jīng)轉(zhuǎn)移液浸泡的濾紙，然后把硝酸纖維素膜放在濾紙上，保證對齊。
(4)將凝膠平放于纖維素膜上，把另一組3張濾紙放在凝膠上。
(5)將轉(zhuǎn)移槽蓋扣到石墨板上，連接電源，設(shè)電流60-100mA轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。
(6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移膜沖洗后放入1-3％BSA封閉液中，封閉1-2小時(shí)。
(7)快速?zèng)_洗2次，洗膜3次。
(8)把轉(zhuǎn)移膜放入雜交袋，以2-8μl/ml濃度加入一級(jí)抗體鼠抗人MUC1抗體，振搖1-2小時(shí)。
(9)如(7)洗膜。
(10)加入二級(jí)抗體山羊抗鼠IgG-HRP，60倍稀釋。反應(yīng)1-2小時(shí)。
(11)洗膜。
(12)加入底物反應(yīng)5分鐘，底物溶液二氨基聯(lián)苯胺(DAB)7mg，30％H2O210μl溶于TBS溶液。
三.常規(guī)基因測序MUC1-MBP融合蛋白核苷酸序列見附圖8特征長度1710個(gè)堿基類型 核酸鏈性 單鏈四.MUC1-MBP融合蛋白及MBP的純化1.大腸桿菌超聲破碎每克濕重菌加入10-30ml TE緩沖液，超聲破碎，聲頻15-35KHz，10-20次，每次12秒，間隔10秒鐘。4℃，4000-10000rpm離心10-30min，留取上清，SDS-PAGE電泳鑒定。
2.Amyrose親和層析(1)取amylose resin 4ml用蒸餾水洗3次，10ml/次。
(2)將水洗過的amylose resin裝入1.5cm直徑的玻璃柱，柱床體積4ml。
(3)超聲破碎的細(xì)菌上清8ml裝柱。
(4)用洗液(20mM Tris PH 7.4，0.2M NaCL，10mM 2ME，1mMEDTA)洗3次。
(5)測定蛋白含量OD 280/260。
(6)SDS-PAGE電泳鑒定融合蛋白的純度。其純度95％。
5.Sephadex G-25除鹽或超率除鹽(1)Sephadex G-25加水溶漲一個(gè)晚上。
(2)裝入細(xì)長的柱子上。
(3)裝入一個(gè)柱床體積的蛋白溶液，接取過柱流出液。
(4)PBS洗3次，接取洗脫液。
(5)SDS-PAGE電泳、Western blot、ELISA鑒定所純化的蛋白。
6.蛋白質(zhì)定量.利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白濃度.
(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，BSA 300μg/ml.
(2)染色液0.01％考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7％乙醇，8.5％H3PO4，4℃保存。
(3)取10μl MUC1蛋白溶液稀釋100倍加入900μl H2O待用。
(4)配制不同濃度的BSA溶液，0，7，15，30，60，90μg/ml。
(5)分別取上述溶液及待測溶液1ml，加入3ml染色液，室溫15分鐘。
(6)OD595比色測定。
五.MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤活性的測定1.動(dòng)物18-20g雌性C57小鼠購自長春高新動(dòng)物有限公司2.免疫程序每只鼠注射劑量100-500μl，其中含MUC1-MBP和BCG，BCG作為佐劑。頸背部皮下多點(diǎn)及兩側(cè)腹股溝皮下注射，隔周一次，共免疫兩次，在第二周免疫后2-10天取眶上靜脈血檢測抗體效價(jià)。
3.C57小鼠免疫(1)將C57小鼠40只分成4組，3組為對照組，分別是PBS，PBS+BCG，PBS+BCG+MBP；一組為實(shí)驗(yàn)組MUGl-MBP+BCG(2)給藥途徑頸背部皮下多點(diǎn)及兩側(cè)腹股溝皮下注射。
(3)給藥劑量MUC1 10-100μg/只，BCG 1-5mg/只。
(4)免疫程序隔周一次共兩次。
(5)最后免疫的第2-10天眶上靜脈采血測定抗體效價(jià)。
4.抗體效價(jià)測定(1)競爭ELISA用過量的MBP與抗血清發(fā)生發(fā)應(yīng)封閉抗MBP抗體的結(jié)合位點(diǎn)后，分別與MUC1-MBP及MBP發(fā)生反應(yīng)，通過顏色變化的不同來測定抗MUC1抗體的存在。
1)首先用相同摩爾數(shù)的MUC1-MBP及MBP包板，一個(gè)晚上。
2)稀釋抗血清。
3)以終濃度為5、10、20μg/ml的MBP與稀釋的抗血清發(fā)生反應(yīng)1-3h。
4)洗酶標(biāo)板。
5)封閉液封閉1.5h。
6)MBP中和過的抗血清加入酶標(biāo)板反應(yīng)1-2小時(shí)。
7)加底物反應(yīng)5分鐘，加終止液。
8)酶標(biāo)儀測定OD490。
(2)合成MUC1的氨基酸序列，直接用ELISA測定抗MUC1抗體.
5.小鼠CTL細(xì)胞毒活性測定(1)將免疫后的小鼠殺死后無菌取脾。
(2)制備脾細(xì)胞懸液。
(3)調(diào)制靶細(xì)胞MCF-7和Lewis肺癌細(xì)胞濃度。
(4)按照200∶1、100∶1、50∶1和25∶1的效靶比例加入96孔板中，200μl/well，輕輕震蕩混勻，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4-10小時(shí)。
(5)加入MTT 5-20μl/well，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
(6)加100-200μl/well DMSO溶解甲臜。
(7)用酶標(biāo)儀測定OD490。
6.免疫鼠成瘤實(shí)驗(yàn)按上述免疫程序兩次免疫后的第2-10天，用3-7 Grey射線照射小鼠，然后給予MCF7乳腺癌細(xì)胞背部皮下注射，注射細(xì)胞數(shù)為1-5×107/只。在清潔的環(huán)境下飼養(yǎng)，三周后測定腫瘤的大小。
權(quán)利要求
1.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗，其核苷酸序列長度為1710個(gè)堿基，類型為核酸，鏈性為單鏈，1.atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctcggccgat61 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt121 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat181 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt241 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc301 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac361 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa421 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaa gagatcc cggcgctgga taaagaactg481 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg541 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa601 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt661 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa721 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa781 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttc aagggtc aaccatccaa accgttcgtt841 ggcgtgctga gcgcaggtat taa cgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc901 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg961 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc1021 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc1081 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa1141 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1201 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc ccgggctgca ggaattcccc1261.gcccccccag cccacggagt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1321.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1381.gccccccaag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1441.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1501.gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc1561.gcccccccac tccacggtgt cacctcggcc ccggagaaca ggccggcccc gggctccacc1621.gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc ccggagagca ggccggaatt cgatatcaag1681.cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tga
2.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟1)將該MUC1基因450個(gè)堿基按照正確閱讀框插入pMAL-p2原核表達(dá)載體malE基因下游，使MUC1與MBP基因連接到一起，通過酶切鑒定該重組載體pMAL-MUC1的正確性；2)表達(dá)MUC1-MBP融合蛋白的重組質(zhì)粒pMAL-MUC1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在IPTG的誘導(dǎo)下，表達(dá)了分子量62KD的融合蛋白MBP-MUC1，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定其正確性，并得到穩(wěn)定的表達(dá)菌株pMAL-MUC1/DH5a；3)常規(guī)基因測序測定MUC1-MBP融合蛋白的基因序列；4)大量培養(yǎng)pMAL-MUC1/DH5a，經(jīng)過超聲破碎提取全菌體上清液，通過凝膠過濾層析→淀粉糖親和層析→超濾獲得了較純的MUC1-MBP融合蛋白和MBP蛋白。
3.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗用于預(yù)防和治療各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌。
4.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗用于腫瘤手術(shù)后殘留病灶的治療。
5.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗用于BCG作為佐劑增強(qiáng)MUC1-MBP誘導(dǎo)的免疫。
6.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗用于與IL-2或GM-CSF配伍使用。
7.重組人MUC1-MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗用于與化療藥物配伍使用。
全文摘要
發(fā)明公開了一種重組人MUC1－MBP融合蛋白抗腫瘤疫苗及生產(chǎn)工藝，是將MBP基因與MUC1基因融合在一起，研制一種基因工程融合蛋白疫苗。用MBP代替其他的融合蛋白誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。pMAL－p2是高效表達(dá)麥芽糖融合蛋白的原核表達(dá)載體，將MUC1基因的串聯(lián)重復(fù)序列插入malE基因的下游，一方面能在大腸桿菌中直接高效誘導(dǎo)表達(dá)與MBP融合的蛋白，另一方面省卻了化學(xué)合成融合蛋白的步驟。發(fā)明適用于預(yù)防和治療各種腺癌及其轉(zhuǎn)移癌；腫瘤手術(shù)后殘留病灶的治療；BCG作為佐劑增強(qiáng)MUC1－MBP誘導(dǎo)的免疫；與IL－2或GM－CSF配伍使用；與化療藥物配伍使用等醫(yī)療用途。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1513556SQ0311104
公開日2004年7月21日 申請日期2003年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者臺(tái)桂香 申請人:臺(tái)桂香