專利名稱：：用吖啶或吖啶衍生物協(xié)助滅活病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用吖啶或吖啶衍生物，優(yōu)選聯(lián)合使用氯芐烷銨來滅活包膜或無包膜的病毒。優(yōu)選地，在較大地保留蛋白質(zhì)生物活性之下進(jìn)行本發(fā)明的方法。多年來人們已經(jīng)知道，未處理的人類血漿或血清中可能含有使人致病的病毒，如HIV，HBV或HCV，這些病毒一旦傳染給易感受體，就可能引起嚴(yán)重的疾病如AIDS或肝炎。為了預(yù)防這種潛在的病毒傳染，在制備從人體血漿或血清中獲得的治療劑時(shí)，一方面，僅僅從預(yù)選的，任何人都能判斷是無病毒的起始物質(zhì)開始制備，另一方面，在制備過程中采用病毒—滅活/消除措施。通過精密測定和連續(xù)校對，確定所用的病毒滅活/消除法的功效。在制備上述治療劑中，除物理滅活病毒措施外，化學(xué)滅活病毒措施也是已知的。尤其經(jīng)常討論的化學(xué)方法是SD(溶劑/清潔劑)法。它適用于滅活包膜病毒，即由含脂質(zhì)的膜包裹著的病毒，但存在嚴(yán)重的不利之處，即對所有已知無包膜(無膜的)病毒完全無效。而且，也已知無其它化學(xué)方法適于滅活無包膜病毒同時(shí)又保留治療劑或人體血漿或血清中蛋白質(zhì)組分的生物活性。盡管化學(xué)滅活病毒法僅用于補(bǔ)充物理法的能力，并且盡管大多數(shù)通過血液或血制品潛在傳染的病毒具有脂質(zhì)膜，為了安全，特別需要建立也能確實(shí)滅活無包膜病毒的有效的化學(xué)滅活法。當(dāng)最近象討論通過血液或血制品潛在傳染的病毒一樣，討論HAV和細(xì)小病毒如細(xì)小病毒B19時(shí)，這一點(diǎn)更加吸引人(VoxSanguinis67，Supplementl，1994ProceedingsofaSymposiumbeldattheNewYorkBloodCenter)。本發(fā)明的目的也在于開發(fā)一種工業(yè)上可用的化學(xué)滅活病毒的方法，該方法可滅活包膜的和無包膜的病毒，如細(xì)小病毒，并保留所含蛋白質(zhì)(如治療劑中使用的蛋白質(zhì))的生物活性。通過向待處理的含蛋白液體中加入吖啶或吖啶衍生物，可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。意外地發(fā)現(xiàn)，吖啶或吖啶衍生物可以滅活包膜的或無包膜的病毒。例如，吖啶衍生物為利凡諾，9-氨基吖啶(即己基間苯二酚氨基吖啶)，3，6-二氨基吖啶(普魯黃素)，吖啶鎖辛，AcrizaneChloride(氯化酚吖啶)，吖啶橙，喹吖啶，acricide，吖啶酮，吖啶-9-羧酸，氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧-9-吖啶基)氨基]-3-二乙氨-2-丙醇二鹽酸鹽)，3，7-二氨基-5-苯基吩嗪鹽酸鹽(酚藏紅花，藏紅BExtra)，吩惡嗪，吩噻嗪且特別為吖啶黃(3，6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3，6-二氨基吖啶)及其鹽，例如氯化物，硫酸鹽，溴化物。意外地還發(fā)現(xiàn)，吖啶或吖啶衍生物和氯芐烷銨合用，在病毒滅活期間顯示協(xié)同作用，即合用下滅活病毒的數(shù)量比單用每種物質(zhì)都要高。本發(fā)明滅活病毒法可在蛋白溶液如血液，血清，血漿，血制品，尿囊液或奶中進(jìn)行。滅活病毒的條件為PH3-10或5-9(例如在血清或血漿溶液中)并且溫度為1℃-80℃，優(yōu)選20℃-60℃，特別優(yōu)選20℃-40℃，或25℃-37℃，持續(xù)30分鐘-10小時(shí)，優(yōu)選2-5小時(shí)。為了滅活病毒，所用吖啶或吖啶衍生物的濃度為1.0g/l-0.00001g/l或1.0g/l-0.004g/l，優(yōu)選0.1g/l-0.001g/l并且氯芐烷銨的濃度為0.1g/l-0.004g/l，優(yōu)選0.05g/l-0.01g/l。如果必要，可通過簡單的，公知的方法如活性炭吸附或透析，除去蛋白溶液中的吖啶和氯芐烷銨。本發(fā)明滅活病毒法進(jìn)一步的好處是對待處理物質(zhì)中蛋白組分極大的保護(hù)作用不同的生物活性，例如抗體活性和凝集活性，都不減小或僅減小可接受的范圍。因此，本發(fā)明滅活病毒法可用于，例如消除下列物質(zhì)的污染—含蛋白溶液(稀的或濃的)—血液或血制品；液體和細(xì)胞組分—血清，血漿—尿囊液—器官提取物—奶—緩沖溶液—診斷抗原—疫苗，疫苗抗原本發(fā)明的方法更進(jìn)一步適用于消毒病毒污染的，例如區(qū)域，設(shè)備，坑水，廢棄物和各種表面。也可用于消毒病毒污染的器官移值物如角膜、腦膜、肝、心臟、肺或腎臟。通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步來說明本發(fā)明。本發(fā)明工藝中通常使用的方法病毒用已知的方法在組織培養(yǎng)物中復(fù)制；將病毒收集物離心并用作進(jìn)一步研究的起始物。在微量滴定板上(每稀釋段有8個(gè)0.1ml的樣品)，通過雙滴定(doubletitration)來測定傳染效價(jià)(infectiousnesstiter)。貯備液乳酸利凡諾(EL)3％的蒸餾水溶液Entozon(E)3％的吖啶蒸餾水液吖啶黃(A)1％的蒸餾水溶液氯芐烷銨(BACI)10％的蒸餾水溶液通常的實(shí)驗(yàn)步驟將9份緩沖液或溶媒或蛋白質(zhì)溶液與1傷病毒混合。加入一定量各滅活病毒實(shí)施例中標(biāo)明的并重新與后面的病毒滴定液混合的貯備液。在各實(shí)施例提到的時(shí)間和溫度后，移開樣品并用雙測定法滴定，以便能測定與方法相關(guān)的病毒滅活。用于研究的病毒種類縮寫名稱PI3V牛副流感3號(hào)病毒BPV牛細(xì)小病毒PPV豬細(xì)小病毒IBRV傳染性牛鼻氣管炎病毒BVDV牛病毒性腹瀉病毒CPV犬細(xì)小病毒BAV-11型牛腺病毒Reo33型呼腸孤病毒流感A流感A病毒—山東流感B流感B病毒—B巴拿馬本文進(jìn)一步使用的縮寫/名稱EME培養(yǎng)基伊格爾最小必需培養(yǎng)基BeriateP凝集因子VIII施行巴氏消毒的補(bǔ)體濃縮物(BehringwerlcsAG，Marburg，Germany)HaemateP施行巴氏消毒的凝集因子VIII和Von-Wille-brand因子的濃縮物(BehringwerkeAG，Mar-burg，Germany)BeriplexP施行巴氏消毒的凝血酶原復(fù)合物的濃縮物(BehringwerkeAG，MarburgGermany)Venimmun靜脈用人體多價(jià)免疫球蛋白制劑(7S)(Behring-werkeAG，Marburg，Germany)Entozon下列組合物的制劑每1g顆粒中含0.059g二甲氧基-6-硝基-9-[(3-二乙基氨基-2-羥基)丙基氨基]吖啶二鹽酸化物和0.295g乳酸利凡諾(ASIDVeterinarVertriebsGmbH)QAE纖維素二乙基-2-羥基丙基氨基乙基纖維素(蛋白提純用離子交換劑)FCS胎兒腓腸血清實(shí)施例1用BACI滅活PI3V將EME培養(yǎng)基與PI3病毒和BACl混合并在37℃水浴上恒溫培養(yǎng)。經(jīng)指定的時(shí)間后，樣品進(jìn)行病毒滅活試驗(yàn)。結(jié)果見表1。表1在37℃下，用BACI滅活PI3病毒1相當(dāng)于加入BACI并完全與反應(yīng)原料混合的時(shí)間從表1結(jié)果可見，用高劑量的BACI(0.1mg/ml，0.05mg/ml)迅速滅活PI3病毒，即在為測定PI3病毒傳染性而將含病毒樣品與BACI完全混合，取樣并滴定所需要的時(shí)間里，傳染性的病毒不見了。在其它兩個(gè)BACI試驗(yàn)濃度(0.025mg/ml和0.0125mg/ml)，看得出病毒滅活明顯具有濃度—時(shí)間依賴關(guān)系。實(shí)施例2用BACI或Entozon滅活病毒用BACI或Entozon來處理表2所示的病毒樣品并在45℃下恒溫培養(yǎng)。試驗(yàn)開始1或2小時(shí)取樣進(jìn)行病毒滴定。表2在45℃下，通過BACI或Entozon法滅活病毒表2結(jié)果顯示，在選擇的試驗(yàn)條件下，用BACI不滅活BPV。用Entozon滅活是可能的，實(shí)際上，滅活BPV比滅活PPV更快。實(shí)施例3用BACI和吖啶黃滅活病毒用BACI或吖啶黃來處理表3所示的病毒樣品的懸浮液并在37℃恒溫培養(yǎng)2小時(shí)。為測定病毒滅活情況，取樣滴定。表3</tables>表3結(jié)果顯示，BACI和吖啶黃都能滅活包膜病毒—IBRV，PI3V，BVDV，BACI的滅活作用稍大些。吖啶黃可滅活無膜病毒BPV，但BACI單獨(dú)用不能。發(fā)現(xiàn)在EME培養(yǎng)基中用吖啶黃和BACI可滅活病毒之后，檢查這些物質(zhì)是否也能滅活存在于含蛋白溶液中的病毒。用標(biāo)明的病毒樣品來處理下列蛋白溶液BeriplexRPPV馬血清BVDV，BPVBeriateBVDV，BPV，BAV-1，Reo3，IBRVHoematePPV，Reo3VenimmunnBVDV，PPV，CPVFCSCPV卵尿囊液流感A，流感B這些實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果以下面表格形式表示。實(shí)施例4用存在于蛋白溶液中的吖啶和氯芐烷銨來滅活病毒表4結(jié)果顯示，按方法學(xué)上簡單的方法，在蛋白溶液中用吖啶和/或氯芐烷銨來完全地滅活不同的病毒是可能的。然而這里清晰可見，單獨(dú)用氯芐烷銨只能滅活含包膜的病毒，而用吖啶卻能滅活含包膜的病毒而且也能滅活無包膜的病毒樣品。兩種物質(zhì)在殺病毒作用上具有協(xié)同作用，即合用吖啶黃和氯芐烷銨滅活病毒的數(shù)量高于單用兩種物質(zhì)。表4結(jié)果也顯示，在蛋白溶液中滅活病毒依賴于1.被滅活的病毒的種類2.蛋白溶液的組分和性質(zhì)3.滅活劑的濃度4.滅活時(shí)間5.滅活溫度滅活病毒也依賴于PH—來顯示該結(jié)果。在PH低于5.5時(shí)，病毒滅活比高PH時(shí)更慢。表5-7包含用吖啶黃和/或氯芐烷銨滅活病毒后，蛋白溶液生物活性的結(jié)果。用VenimmunR通過測定病毒滅活前后抗體的含量和用HaematcR，BeriateR和BeriplexR通過測定促凝集活性來測定生物活性—用國際單位測定。表4在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒<p>表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶或氯芐烷銨滅活病毒>表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒<p>表5測定用吖啶黃和氯芐烷銨滅活病毒，前后蛋白溶液的生物活性(抗體效價(jià))1根據(jù)Spenarmn-Karber法，每個(gè)稀釋段用8個(gè)樣品，以log2稀釋度來計(jì)算效價(jià)20.001mg吖啶黃10.62mgmlBACI表6測定用吖啶黃和氯芐烷銨(BACL)滅活病毒前后蛋白溶液的生物活性(抗體效價(jià))<1用log2稀釋度測定效價(jià)2I.＝滅活劑0.001mg/me吖啶黃+0.02mg/mlBACI表7測定用吖啶黃(A)和氯芐烷銨(BACL)滅活病毒—前后蛋白溶液的生物活性(凝集活性)<p>表5和6的結(jié)果顯示，在用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒期間，在Venimmun中滅活(1型脊髓灰質(zhì)炎，和抑制血細(xì)胞凝集(HAH)抗體(Pl3和Reo3病毒)的含量的影響不超過試驗(yàn)變化范圍(常量±1個(gè)log，稀釋段)。用吖啶/氯芐烷銨滅活后，凝集制劑(Boriate，Hae-mate，Beriplex)的活性減小是可授受的(表7)。權(quán)利要求1.一種滅活病毒的方法，其包括使用吖啶或吖啶衍生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中另外使用氯芐烷胺。3.在蛋白質(zhì)存在下進(jìn)行權(quán)利要求1或2的方法并且其中保留這些蛋白質(zhì)的生物活性。4.權(quán)利要求1，2或3的方法，其中在20-60℃下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。5.上述權(quán)利要求1-4中任一方法，其中溫度為25-37℃。6.上述權(quán)利要求1-5中任一方法，其中在PH5-9下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。7.上述權(quán)利要求1-6中任一方法，其中以0.0001到1.0g/l的濃度使用吖啶或吖啶衍生物。8.權(quán)利要求7的方法，其中以0.0005到0.1g/l的濃度使用吖啶或吖啶衍生物。9.上述權(quán)利要求2-8中任一方法，其中以0.004到0.1g/l的濃度使用氯芐烷銨。10.權(quán)利要求9的方法，其中以0.001到0.05g/l的濃度使用氯芐烷銨。11.上述權(quán)利要求1-10中任一方法，其中恒溫培養(yǎng)的時(shí)間為0.5h-10.0h。12.權(quán)利要求11的方法，其中恒溫培養(yǎng)的時(shí)間為2-5h。13.上述權(quán)利要求1-12中任一方法，其中病毒為細(xì)小病毒或其它無包膜病毒。14.上述權(quán)利要求1-13中任一方法，其中病毒為包膜的病毒。全文摘要本發(fā)明涉及使用吖啶或吖啶衍生物，優(yōu)選合用氯芐烷銨來滅活包膜或無包膜的病毒。優(yōu)選地，在較大地保留所含蛋白生物活性下進(jìn)行本發(fā)明方法。文檔編號(hào)A61L2/00GK1132249SQ95120599公開日1996年10月2日申請日期1995年12月8日優(yōu)先權(quán)日1994年12月10日發(fā)明者D·伯恩哈特申請人:柏林魏克股份公司