專利名稱：一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多孔支架材料的制備方法，特別涉及一種以絲素蛋白為原料， 制備具有同細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的納米纖維化多孔支架的技術(shù)，所制備的材料可應(yīng)用于 生物醫(yī)學(xué)、組織修復(fù)、藥物釋放、組織工程等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)用材料是未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较蚝蛻?yīng)用領(lǐng)域。用于組織工程 和組織修復(fù)的生物材料多孔支架，在要求具有良好的生物相容性和可降解性的同時，還 應(yīng)當(dāng)具有合適的多級結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控細胞行為，促進正常組織再生。細胞外基質(zhì)是多孔 支架制備的最佳模板，其主要由納米纖維組成，并進一步形成孔隙在100微米以上的多 孔結(jié)構(gòu)。大量研究表明，納米纖維的形成能有效地調(diào)控細胞行為，促進細胞的粘附、生 長和增殖，使得生物材料多孔支架具有更好的生物相容性。絲素蛋白是蠶絲中的主要成分，價格低廉，易于提純。研究表明，絲素蛋白無 毒、無免疫原性、生物相容性良好、可降解、力學(xué)性能優(yōu)良，是制備組織修復(fù)和組織工 程支架的理想原料。絲素蛋白具有包括SilkI和SilkII在內(nèi)的不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)，晶體種類和 晶體含量的不同可以決定絲素蛋白的溶解性和降解性。通過調(diào)整其晶體和非晶體結(jié)構(gòu)， 絲素蛋白在體內(nèi)的降解速率可以從1年降低到半個月左右，從而滿足不同組織修復(fù)和再 生的需要。目前，研究者已經(jīng)研究出多種制備絲素蛋白多孔支架的方法，包括冷凍干燥 法、相分離法、鹽析法以及靜電紡絲法等，但如上的各種方法都存在各自難以克服的不 足。例如，鹽析法制備出的絲素蛋白支架孔徑一般在400微米以上，而靜電紡絲法制備 的多孔材料，孔徑則一般在100微米以下，用作組織修復(fù)和組織工程支架材料都存在一 定的限制。冷凍干燥法可以制備出孔徑范圍較大的多孔支架，但在冷凍過程中，絲素蛋 白容易自組裝成片狀結(jié)構(gòu)，很難形成結(jié)構(gòu)良好的多孔結(jié)構(gòu)。并且，上所有方法所制備出 的絲素蛋白基多孔支架，都不具備同細胞外基質(zhì)相似的納米纖維結(jié)構(gòu)，在組織相容性方 面仍有待提高。細胞外基質(zhì)大部分由直徑在100納米以下的納米纖維組成，具有同細胞外基質(zhì) 結(jié)構(gòu)相似的納米纖維所組成的多孔支架具有更好的生物相容性，能夠顯著提高細胞的生 長和新生組織的形成。因此，需要克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，研發(fā)一種利用絲素蛋白制備具有同細 胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的納米纖維化多孔支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法，改善絲素 蛋白基多孔支架的組織相容性。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法，包括以下步驟
1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到絲素蛋白溶液，所述絲素蛋白溶液 的質(zhì)量濃度為0.1 20% ；將膠原溶解到質(zhì)量濃度為0.01-0.1%的乙酸溶液中，得到膠原 蛋白溶液，所述膠原蛋白溶液的質(zhì)量濃度為0.01% 2% ；
2)將絲素蛋白溶液同膠原蛋白溶液共混，混合后，絲素蛋白和膠原蛋白的質(zhì)量比為 100 2 20，在0 20°C的條件下靜置10分鐘 24小時，得到絲素蛋白和膠原蛋白的 混合溶液；
3)將絲素蛋白和膠原的混合溶液注入模具中，在-10 -80°C的低溫條件下經(jīng)過1 24小時的冷凍過程，進行冷凍處理獲得冷凍體；對冷凍結(jié)晶體進行冷凍干燥處理，得到 可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架；
4)將可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架放置在真空干燥器中，進行真 空處理20分鐘 24小時，獲得不溶于水的納米纖維化絲素蛋白多孔支架；所述真空干燥 器底部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液。上述技術(shù)方案中，步驟1)中，將絲素蛋白溶液在0 80°C條件下放置1 48 小時。上述技術(shù)方案中，步驟4)中，甲醇水溶液的體積濃度1 100% ；乙醇水溶液 體積濃度為1 100%。優(yōu)選的技術(shù)方案中，一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法，包括以 下步驟
1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，所述絲素蛋 白水溶液的質(zhì)量濃度為0.5% 5%，并在0 10°C下靜置30分鐘以上；將膠原溶解到質(zhì) 量濃度為0.01 0.1%的乙酸溶液中，所述膠原蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0.05% 0.5%， 并在0 10°C下靜置30分鐘至2小時；
2)在0 10°C下，混合均勻絲素蛋白水溶液和膠原蛋白水溶液，混合后，絲素蛋白 的質(zhì)量濃度為0.2% 3%，膠原蛋白的質(zhì)量濃度為0.02% 0.2%，靜置4 10小時，得 到絲素蛋白和膠原蛋白的混合溶液；
3)將絲素蛋白和膠原的混合溶液注入模具中，在-10 -30°C的低溫條件下經(jīng)過 20 24小時的冷凍過程，進行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進行冷凍干燥處理，獲得 可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架；
4)將可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架放置在真空干燥器中，進行真 空處理4小時以上，獲得不溶于水的納米纖維化絲素蛋白多孔支架；所述真空干燥器底 部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液，在抽真空后，干燥器中形成水、甲醇或者乙醇的 飽和蒸汽，從而促進絲蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。進一步優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟1)中，所述絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為 1% 2% ；所述膠原蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0.075% 0.2% ；步驟2)中，混合均勻 絲素蛋白水溶液和膠原蛋白水溶液時，取等體積的絲素蛋白水溶液和膠原蛋白水溶液。本發(fā)明同時要求保護采用上述技術(shù)方案制備得到的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖 維化多孔支架，所述納米纖維化多孔支架由納米纖維構(gòu)成，所述納米纖維直徑在10-100 納米之間；所述納米纖維化多孔支架具有孔徑為10 1000微米的相互貫通的孔隙，孔隙率在80%以上。上述納米纖維化多孔支架的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和組成可調(diào)，降解速率可調(diào)。本發(fā)明的原理是絲素蛋白在水溶液中存在緩慢的自組裝過程，能夠逐漸由分 散的分子自組裝成納米球或者進一步組裝成納米線，一旦組裝成功，絲素蛋白能夠在相 對較長時間保持穩(wěn)定，在水溶液中能夠穩(wěn)定存在。如上自組裝過程受到溫度、親疏水作 用力、溶液濃度、離子強度、pH值、以及時間等的影響，因此通過調(diào)控各種簡單的物理 因素，就可以可控的制備出不同尺寸的絲素蛋白納米球和納米線。在本發(fā)明中，通過將 絲素蛋白和膠原蛋白的混合溫度降低到20°C以下，并延長靜置時間，提高絲素蛋白同膠 原蛋白相互作用的程度，有效促進了絲素蛋白納米纖維的形成；同時，本發(fā)明所提供的 后處理方法，通過在飽和水、甲醇或者乙醇等的真空環(huán)境中對絲素蛋白支架進行處理， 成功獲得了具有不同晶體組成的絲素蛋白多孔支架，在有效降低甚至是取消有毒溶劑使 用的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了絲素蛋白多孔支架的降解可控。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
1)本發(fā)明獲得的多孔支架具有10 1000微米的相互貫通的孔隙，孔壁則是由直徑 在10 100納米的納米纖維組成，同細胞外基質(zhì)具有相似的納米和微米級結(jié)構(gòu)，適合細 胞的粘附和生長，生物相容性顯著提高，有利于組織修復(fù)和組織工程的應(yīng)用；同時不同 的后處理方式能夠有效調(diào)控絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)，從而具有不同的降解性能，以滿足不 同組織再生的需要；整個制備過程不需要添加任何化學(xué)交聯(lián)劑或者發(fā)泡劑，有效保持了 絲素蛋白良好的生物相容性。2)由于制備過程都是在低于常溫、水環(huán)境下完成，所制備過程溫和、易控，不 會弓丨起絲素蛋白生物相容性的降低。3)在制備過程中，可以通過調(diào)節(jié)冷凍溫度、溶液濃度等參數(shù)，控制冰晶的大 小，從而方便地達到控制絲素蛋白多孔支架孔結(jié)構(gòu)的目的，滿足不同應(yīng)用的要求。4)后處理過程中，通過更換處理溶液，能夠有效地控制所制備絲素蛋白多孔支 架的晶體結(jié)構(gòu)，從而達到控制其降解速率的目的。


圖1是實施例一中制備的絲素蛋白/膠原多孔支架和普通冷凍干燥法制備的多孔 支架材料的掃描電鏡圖；其中(a)為普通冷凍干燥法制備的多孔支架，(b)為實施例 一技術(shù)方案制備的絲素蛋白/膠原多孔支架。圖2是實施例一中制備的絲素蛋白/膠原多孔支架和普通冷凍干燥法制備的多孔 支架材料的紅外結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例一
本實施例所提供的絲素蛋白多孔支架制備步驟如下
1)將5克蠶繭加入2升質(zhì)量濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，于98 100°C處理40分 鐘，脫去外部的絲膠蛋白，充分洗滌后獲得純的絲素蛋白。將干燥后的絲素蛋白在60°C左右溶解到9.3摩爾/升的溴化鋰溶液中，獲得絲素蛋白混合溶液。2)將絲素蛋白混合溶液加入纖維素透析膜，用去離子水進行透析，去除溴化 鋰，得到純的絲素蛋白水溶液。3)將絲素蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)到1%，放置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在 4°C。4)將膠原蛋白溶液稀釋到0.075%，放置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在 4°C。5)在4°C條件下，將同體積的絲素蛋白溶液和膠原蛋白溶液共混，放置6小 時。6)將混合溶液注入到模具中，在-20°C冷凍24小時，得到絲素蛋白/膠原蛋白 冷凍體。7)將冷凍后的絲素蛋白/膠原蛋白混合物放入冷凍干燥機，經(jīng)48小時冷凍干燥 處理，獲得可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架。8)將此多孔支架放入底部加有水的真空干燥器中，真空處理6小時，獲得不溶 于水的絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架。參見附圖1，它是按上述技術(shù)方案制備的絲素蛋白多孔支架和普通冷凍干燥法制 備出的多孔支架的掃描電鏡圖。由此可以看出，普通冷凍干燥法制備出的絲素蛋白支架 為片狀結(jié)構(gòu)，孔壁中沒有納米纖維存在；而本技術(shù)方案制備出的絲素蛋白/膠原蛋白多 孔支架，不僅形成了良好的多孔結(jié)構(gòu)，孔直徑在200-400微米之間，同時孔壁完全由納 米纖維組成，纖維直徑小于lOOnm。參見附圖2，它是按上述技術(shù)方案制備的絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架的紅外 光譜圖。從中可以發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架的特征吸收峰出現(xiàn)在1650和 1630cm_l，表明其同時存在silkl禾Π silkII晶體結(jié)構(gòu)。實施例二
將5克蠶繭加入2升質(zhì)量濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，于98 100°C處理40分鐘， 脫去外部的絲膠蛋白，充分洗滌后獲得純的絲素蛋白。將干燥后的絲素蛋白在60°C左右 溶解到9.3摩爾/升的溴化鋰溶液中，獲得絲素蛋白混合溶液。將絲素蛋白混合溶液加入纖維素透析膜，用去離子水進行透析，去除溴化鋰， 得到純的絲素蛋白水溶液。將絲素蛋白溶液在60°C放置24小時，隨后將絲素蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)到2%，放 置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。將膠原蛋白溶液稀釋到0.2%，放置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。在4°C條件下，將同體積的絲素蛋白溶液和膠原蛋白溶液共混，放置6小時。將混合溶液注入到模具中，在-20°C冷凍24小時，得到絲素蛋白/膠原蛋白冷凍 體。將冷凍后的絲素蛋白/膠原蛋白混合物放入冷凍干燥機，經(jīng)48小時冷凍干燥處 理，獲得可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架。將此多孔支架放入底部加有水的真空干燥器中，真空處理6小時，獲得不溶于 水的絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔徑在100-200微米，孔隙率在90%以上，晶體結(jié)構(gòu)為silk I和silk II共存。實施例三
將5克蠶繭加入2升質(zhì)量濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，于98 100°C處理40分鐘， 脫去外部的絲膠蛋白，充分洗滌后獲得純的絲素蛋白。將干燥后的絲素蛋白在60°C左右 溶解到9.3摩爾/升的溴化鋰溶液中，獲得絲素蛋白混合溶液。將絲素蛋白混合溶液加入纖維素透析膜，用去離子水進行透析，去除溴化鋰， 得到純的絲素蛋白水溶液。將絲素蛋白溶液在60°C放置24小時，隨后將絲素蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)到1%，放 置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。將膠原蛋白溶液稀釋到0.075%，放置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。在4°C條件下，將同體積的絲素蛋白溶液和膠原蛋白溶液共混，放置6小時。將混合溶液注入到模具中，在-20°C冷凍24小時，得到絲素蛋白/膠原蛋白冷凍 體。將冷凍后的絲素蛋白/膠原蛋白混合物放入冷凍干燥機，經(jīng)48小時冷凍干燥處 理，獲得可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架。將此多孔支架放入底部加有80%乙醇溶液的真空干燥器中，真空處理6小時， 獲得不溶于水的絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔徑在200微米以上，孔 隙率在90%以上，主要晶體結(jié)構(gòu)為silk II。實施例四
將5克蠶繭加入2升質(zhì)量濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，于98 100°C處理40分鐘， 脫去外部的絲膠蛋白，充分洗滌后獲得純的絲素蛋白。將干燥后的絲素蛋白在60°C左右 溶解到9.3摩爾/升的溴化鋰溶液中，獲得絲素蛋白混合溶液。將絲素蛋白混合溶液加入纖維素透析膜，用去離子水進行透析，去除溴化鋰， 得到純的絲素蛋白水溶液。將絲素蛋白溶液在60°C放置24小時，隨后將絲素蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)到1%，放 置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。將膠原蛋白溶液稀釋到0.075%，放置到4°C下1小時，使溶液溫度穩(wěn)定在4°C。在4°C條件下，將同體積的絲素蛋白溶液和膠原蛋白溶液共混，放置6小時。將混合溶液注入到模具中，在-20°C冷凍24小時，得到絲素蛋白/膠原蛋白冷凍 體。將冷凍后的絲素蛋白/膠原蛋白混合物放入冷凍干燥機，經(jīng)48小時冷凍干燥處 理，獲得可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架。將此多孔支架放入底部加有80%甲醇溶液的真空干燥器中，真空處理6小時， 獲得不溶于水的絲素蛋白/膠原蛋白多孔支架。此多孔支架的孔徑在200微米以上，孔 隙率在90%以上，主要晶體結(jié)構(gòu)為silk II。
權(quán)利要求
1. 一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到絲素蛋白溶液，所述絲素蛋白溶液 的質(zhì)量濃度為0.1 20% ；將膠原溶解到質(zhì)量濃度為0.01 0.1%的乙酸溶液中，得到膠 原蛋白溶液，所述膠原蛋白溶液的質(zhì)量濃度為0.01% 2% ；2)將絲素蛋白溶液同膠原蛋白溶液共混，混合后，絲素蛋白和膠原蛋白的質(zhì)量比為 100 2 20 ；在0 20°C的條件下靜置10分鐘 24小時，得到絲素蛋白和膠原蛋白 的混合溶液；3)將絲素蛋白和膠原蛋白的混合溶液注入模具中，在-10 -80°C的低溫條件下經(jīng) 過1 24小時的冷凍過程，進行冷凍處理獲得冷凍體；對冷凍結(jié)晶體進行冷凍干燥處 理，得到可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架；4)將可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架放置在真空干燥器中，進行真 空處理20分鐘 24小時，獲得不溶于水的納米纖維化絲素蛋白多孔支架；所述真空干燥 器底部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟1)中，將絲素蛋白溶液在0 80°C條件下放置1 48小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟4)中，甲醇水溶液的體積濃度 為1 100% ；乙醇水溶液體積濃度為1 100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟1)按常規(guī)方法先將蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，所述絲素蛋 白水溶液的質(zhì)量濃度為0.5% 5%，并在0 10°C下靜置30分鐘以上；將膠原溶解到質(zhì) 量濃度為0.01 0.1%的乙酸溶液中，所述膠原蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0.05% 0.5%， 并在0 10°C下靜置30分鐘至2小時；2)在0 10°C下，混合均勻絲素蛋白水溶液和膠原蛋白水溶液，混合后，絲素蛋白 的質(zhì)量濃度為0.2% 3%，膠原蛋白的質(zhì)量濃度為0.02% 0.2%，靜置4 10小時，得 到絲素蛋白和膠原蛋白的混合溶液；3)將絲素蛋白和膠原的混合溶液注入模具中，在-10 -30°C的低溫條件下經(jīng)過 20 24小時的冷凍過程，進行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進行冷凍干燥處理，獲得 可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架；4)將可溶的絲素蛋白/膠原蛋白納米纖維化多孔支架放置在真空干燥器中，進行真 空處理4小時以上，獲得不溶于水的納米纖維化絲素蛋白多孔支架；所述真空干燥器底 部含有水、甲醇水溶液或乙醇水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述絲素蛋白水溶液的 質(zhì)量濃度為1% 2%;所述膠原蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為0.075% 0.2%;步驟2)中， 混合均勻絲素蛋白水溶液和膠原蛋白水溶液時，取等體積的絲素蛋白水溶液和膠原蛋白 水溶液。
6.采用權(quán)利要求1、2、3、4或5中的一種的制備方法制備得到的絲素蛋白/膠原蛋 白納米纖維化多孔支架，其特征在于，所述納米纖維化多孔支架由納米纖維構(gòu)成，所述 納米纖維直徑在10 100納米之間；所述納米纖維化多孔支架具有孔徑為10 1000微 米的相互貫通的孔隙，孔隙率在80%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多孔支架材料的制備方法，公開了一種納米纖維化絲素蛋白基多孔支架的制備方法將絲素溶液和膠原蛋白溶液在0～20℃下共混靜置，促使膠原蛋白同絲素蛋白充分作用，以形成納米纖維；然后將混合溶液進行冷凍，獲得冷凍體；將冷凍體進行冷凍干燥處理，得到納米纖維化多孔支架材料；將此多孔支架材料放入底部加有水、甲醇、或者乙醇水溶液的真空干燥器，抽真空后靜置；獲得不溶于水的納米纖維化多孔支架；獲得的多孔支架具有10～1000微米的相互貫通的孔隙，孔壁則是由直徑在10～100納米的納米纖維組成，同細胞外基質(zhì)具有相似的納米和微米級結(jié)構(gòu)，適合細胞的粘附和生長，具有良好的生物相容性。
文檔編號A61L27/24GK102008756SQ20101058319
公開日2011年4月13日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者呂強, 羅崢 申請人:絲科普樂(北京)生物科技有限公司, 蘇州大學(xué)