專利名稱：槲皮素在制備nlrp3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物槲皮素的新用途，具體地說是涉及槲皮素在制備NLRP3 炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用，特別是涉及制備治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性及炎性損害的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
槲皮素為天然黃酮類成分。NLRP3炎癥小體由NLRP3(N0D-like receptor protein 3)、 ASC (apoptosis-associated speck-like protein)禾口 Caspase-1 組成[Duewell P, Kono H, Rayner KJ et al (2010) NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature 464: 1357-1361]。研究證實,NLRP3 炎癥小體可被多種內(nèi)源性因子代謝紊亂異常激活，包括高尿酸血癥[Gasse P, Riteau N, Charron S et al (2009) Uric acid is a danger signal activating NALP3 inflammasome in lung injury inflammation and fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 179: 903-913]> 高血糖[Schroder K, R Zhou, et al. (2010) The NLRP 3 inf lammasome: a sensor for metabolic danger ？ Science 327(5963): 296-300·]、血月旨紊舌L [Cholesterol crystals activate the NLRP3 inflammasome in human macrophages: a novel link between cholesterol metabolism and inflammation. PLoS ONE 5: ell765]等等。最新的研究證實，NLRP3炎癥小體的異常激活會誘導(dǎo)腎臟組織產(chǎn)生包括脂肪變性和炎性損害在內(nèi)的一系列功能性和器質(zhì)性損害[A Vilaysane, J Chun, ME Seamone et al (2010) The NALP3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to CKD. J Am Soc Nephrol 21: 1732-1744; Navarro-Gonzalez JF, Mora-Fernandez C (2008) The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 19: 433—442]。 而目前國內(nèi)外尚無針對抑制NLRP3炎癥小體治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性及炎性損害的藥物；本發(fā)明涉及槲皮素制備NLRP3炎癥小體抑制藥物，可針對性治療尿酸、血糖、血脂等一系列內(nèi)源性因子代謝紊亂誘導(dǎo)的腎臟組織脂肪變性及炎性損害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供槲皮素的新用途，具體地說是提供槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用；該藥物可有效治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性及炎性損害。本發(fā)明的技術(shù)解決方案提供槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用。 該應(yīng)用包括了以槲皮素為主料，配以本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的藥用輔料(賦形劑、助溶劑、控釋劑等)，用常規(guī)的制劑方法制成本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的劑型(包括口服液、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、微囊劑等)，用于制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用；該藥物用于治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性及炎性損害。本發(fā)明的優(yōu)點是，提供了對NLRP3炎癥小體具有確切抑制調(diào)節(jié)作用的槲皮素用于制備NLRP3炎癥小體抑制藥物，用于治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性和炎性損害及其它與NLRP3炎癥小體異常激活相關(guān)的疾病。本發(fā)明具有3個明顯的進步和優(yōu)點1、成分明確 (槲皮素)；2、作用靶點明確(NLRP3炎癥小體)；3、調(diào)節(jié)作用明確(抑制調(diào)節(jié))。
本發(fā)明利用高尿酸血癥大鼠模型、果糖大鼠模型、STZ糖尿病大鼠模型等代謝紊亂模型在組織細(xì)胞水平、基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平上科學(xué)地評價并確定了槲皮素對 NLRP3炎癥小體的抑制調(diào)控作用以及對代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性及炎性損害的改善作用。本發(fā)明所涉及的槲皮素對代謝紊亂模型動物表達異常升高的NLRP3炎癥小體組分具有確切的抑制作用；而對正常動物正常水平的NLRP3炎癥小體表達無顯著抑制作用， 具有很好的安全性。為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用槲皮素的藥理實驗及結(jié)果來說明其在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用。
具體實施例方式以下實施例僅作為講一步闡沭發(fā)明之用，不能用來限制本發(fā)明。實施例1 槲皮素對NLRP3炎癥小體的抑制調(diào)節(jié)作用和對代謝疾病模型動物腎臟脂肪變性及炎性損害的改善作用。實驗動物SD大鼠，160-200克，雄性。藥物配制選用槲皮素含量為20mg/片的NLRP3炎癥小體抑制藥物片劑，超聲分散于生理鹽水中，用于灌胃給藥，給藥劑量為25 mg/kg。實驗材料=Trizol，DEPC, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液等。實驗儀器高速冷凍離心機，高速勻漿機，Bio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、電泳槽等。實驗?zāi)Ｐ廷俅笫蟾吣蛩嵫Y模型；②果糖大鼠模型；③STZ糖尿病大鼠模型。實驗方法
1、模型的建立動物適應(yīng)環(huán)境1周后，造模。①大鼠高尿酸血癥模型灌胃給予氧嗪酸鉀鹽700mg/kg ；對照給予等體積生理鹽水，造模周期60天。②果糖大鼠模型飲用水給予果糖溶液10%;對照給予自來水，造模周期60天。③STZ糖尿病大鼠模型腹腔注射STZ 55mg/kg，對照給予生理鹽水，造模周期60天。2、給藥造模期間同時給藥，灌胃給予25 mg/kg槲皮素(98%)；對照給予生理鹽水。3、動物處死冰臺上分離腎臟組織，組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-80°C。4、冰凍切片后常規(guī)油紅0染色和HE染色。5、蛋白質(zhì)印跡法(Western-blotting)取組織約IOOmg加入Iml的RIPA裂解液勻漿提取，12000g 4°C離心15分鐘，得腎臟組織總蛋白提取液，Bradford法測蛋白濃度，稀釋蛋白樣品至終濃度為5 ug/ul?；旌仙蠘泳彌_液變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1小時后加入rNLRP3、rACS和rCaspase-1抗體(根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫相應(yīng)蛋白序列制備，使用濃度1:4000) 4°C孵育過夜，二抗(1:4000)室溫?fù)u床孵育1小時，HRP-ECL 發(fā)光，暗室曝光顯影。膠片掃描后對圖片進行灰度分析。6、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)提取大鼠腎臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板， 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的rNLRP3、rACS和rCaspase-Ι基因設(shè)計引物，進行rNLRP3、rACS和 rCaspase-Ι目的基因擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后UV成像，對圖片進行灰度分析。
實驗結(jié)果
a.油紅染色和HE染色
油紅染色結(jié)果顯示相對于正常對照動物，高尿酸血癥模型大鼠腎臟皮質(zhì)出現(xiàn)明顯可見的紅色脂滴，果糖模型和STZ模型大鼠腎臟皮質(zhì)出現(xiàn)數(shù)目眾多的紅色脂滴，包括大型脂滴。25mg/kg槲皮素給藥組動物腎臟皮質(zhì)紅色脂滴均得到有效控制，數(shù)目和體積均明顯下降。HE染色結(jié)果顯示相對于正常對照動物，高尿酸血癥模型、果糖模型和STZ模型大鼠腎小管明顯擴張，腎間質(zhì)可觀察到炎性細(xì)胞浸潤和纖維結(jié)締組織增生(慢性炎)。25mg/kg 槲皮素給藥組動物腎小管的擴張和腎間質(zhì)的慢性炎癥變化均明顯減輕。上述結(jié)果說明25mg/kg槲皮素給藥可有效改善高尿酸血癥模型、果糖模型和STZ 模型大鼠腎臟組織脂肪變性及炎性損害。b.蛋白質(zhì)印跡法 Western-Blotting
Group 模型+槲皮素 η = 5
空白+生理鹽水空白+槲皮素模型+生理鹽水
高尿酸血癥模型
NLRP3 灰度值 30. 5 士 10. 2 士 11.7*
ACS 灰度值42.7 士 8. 3
55. 6 士 12. 3*
Caspase-I 灰度值 17. 5 士 7. 5
25.1 士 9. 8**
果糖模型 NLRP3灰度值 29. 7 士 15. T ACS灰度值 41. 9 士 13. 3*
Caspase-I ^ciJft
26.0 士 9.8**
STZ模型 NLRP3灰度值 37. 5 士 11. T ACS灰度值 10. 4+++ 55.6 士 7.9*
Caspase-I 灰度值30. 1 士 8. 9
40. 1 士 8. 2*
28. 4 士 13. 9 73. 1 士 17. 9++ 49. 0 48.4 士 11.0 82.9 士 17.4++ 18. 4 士 10. 443. 1 士 14. 3++
27. 5 士 6. 1
36. 7 士 9. 3 22. 5 士 7. 4
26.9 士 10.9
38. 4 士 10. 1 18.4 士 10.4
30.5 士 10.2 28.7 士 11.0 38. 0 士 5. 338. 4 士 8. 8
33. 1 士 9. 7
53. 1 士 16. 6++ 79. 8 士 12.4++ 49. 6 士 11.3++
73. 1 士 14. T+ 82. 9 士 56. 3 士 10. 2++
權(quán)利要求
1.槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的NLRP3炎癥小體抑制藥物用于治療代謝疾病誘導(dǎo)的腎臟脂肪變性和炎性損害。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物槲皮素的新用途，具體是涉及槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應(yīng)用。動物試驗結(jié)果表明槲皮素對多種代謝紊亂模型動物腎臟表達異常增高的NLRP3炎癥小體組分具有確切的抑制作用。利用槲皮素配以相關(guān)輔料，用常規(guī)的制劑方法可制成針對性抑制NLRP3炎癥小體的藥物，該藥物可用于治療包括代謝疾病誘導(dǎo)腎臟脂肪變性和炎性損害在內(nèi)的與NLRP3炎癥小體異常高表達相關(guān)的疾病。
文檔編號A61P13/12GK102319237SQ20111023014
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者孔令東, 潘穎, 王闖 申請人:南京大學(xué)