專利名稱：一種從豬血漿中提取凝血酶拮抗劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬食品深加工領(lǐng)域，是農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用開發(fā)。
背景技術(shù)：
早在19世紀(jì)末期，凝血酶就被蘇格蘭的生理學(xué)家發(fā)現(xiàn)并命名，直到1951年凝血酶被純化出來(lái)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序之后，人們對(duì)凝血酶的研究和了解才越來(lái)越深入。凝血酶的生理功能與其絲氨酸蛋白酶的活性有關(guān)，能裂解纖維蛋白原而形成纖維蛋白凝塊，從而促進(jìn)血液凝塊的形成。20世紀(jì)中期，人們就開始將凝血酶應(yīng)用于臨床，由于其療效顯著，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。后來(lái)美英日等國(guó)從牛血漿中分離出凝血酶應(yīng)用于臨床，并證明將動(dòng)物凝血酶應(yīng)用于人體未出現(xiàn)凝血酶抗原性，口服和局部外用時(shí)未產(chǎn)生抗體的過敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)等，因而目前所使用的凝血酶制劑大多來(lái)源于動(dòng)物血漿。凝血酶拮抗劑是一種可以在動(dòng)物體內(nèi)抑制凝血酶活性的物質(zhì)，其可以以凝血酶為靶點(diǎn)，用凝血酶拮抗劑來(lái)抑制血栓的生成，即是臨床治療血栓的方法之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種凝血酶拮抗劑的提取方法，該方法工藝簡(jiǎn)單。所述方法包括血漿分離，加入緩沖液，凝膠柱層析等。1新鮮的檢疫合格的豬血液加入2 3%的檸檬酸三鈉抗凝，加入時(shí)緩慢攪拌防止出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。2使用4°C離心機(jī)在轉(zhuǎn)速5000r/min，離心20min分離出血漿。3在豬血漿里按1 10的比例加入0. 1 0. 5mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7. 0)，
4°C下靜置過夜。4混合液用離心機(jī)分離，離心轉(zhuǎn)速為4000 7000r/min，離心15 30min，收集上清液。5上清液用葡聚糖kphadex G50凝膠柱分離純化，用0. 15mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫未接和的雜蛋白，直到用紫外可見光分光光度計(jì)在^Onm處無(wú)雜蛋白吸收峰。6用0.2mol/L的CH3COONa緩沖液(pH4. 5)洗脫結(jié)合蛋白，用自動(dòng)分離器收集洗脫液。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1檢疫合格的新鮮豬血加入2%檸檬酸三鈉抗凝，邊加邊緩慢攪拌，放置出現(xiàn)溶血。使用高速冷凍離心機(jī)分離血液，在4°C條件下，用5000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，收集上清液。2在50ml血漿中加入500ml的0. 4mol/L的pH7. 0的iTris-HCl緩沖液，4°C下靜置 24h.
3此時(shí)混合液出現(xiàn)渾濁，使用離心機(jī)離心分離，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為5000r/min，離心時(shí)間設(shè)置為20min，收集上清液。4將上清液用葡聚糖kphadex G50凝膠柱過濾，先是用0. 15mol/L pH7. 0的 Tris-HCl緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白，用紫外可見光分光光度計(jì)在^Onm檢測(cè)直到無(wú)雜蛋白吸收峰出現(xiàn)，再用0. 2mol/L pH4. 5的CH3COONa緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，用自動(dòng)分離器回收洗脫液，即為凝血酶拮抗劑粗品。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及到一種從豬血漿中提取凝血酶拮抗劑的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟a)在豬血漿中按1 10比例加入0. 1 0. 5mol/L的1Tris-HCl緩沖液，4°C下靜置過夜；b)過夜的混合液用離心機(jī)分離，轉(zhuǎn)速為4000 7000r/min，離心15 30min；c)收集上清液過葡聚糖凝膠柱，用0.15mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白；d)用紫外可見光分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫情況，直到無(wú)雜蛋白吸收峰；e)用0.2mol/L的CH3COONa緩沖液(pH4. 5)洗脫結(jié)合蛋白，用自動(dòng)分離器收集洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求la，Ic所述的使用的Tris-HCl緩沖液，其特征在于所用到的 Tris-HCl 緩沖液 pH 7. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求Ic所述的葡聚糖凝膠柱，其特征在于所用的SkphadexG50。
4.根據(jù)權(quán)利要求Id洗脫雜蛋白，其特征是在^Onm處檢測(cè)吸收峰。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從豬血漿中提取凝血酶拮抗劑的方法。本方法選用國(guó)內(nèi)資源浪費(fèi)嚴(yán)重的豬血液作為原料，提取凝血酶拮抗劑，具體方法包括沉淀，離心分離及凝膠層析等方法。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102488710SQ20111041537
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者劉歡, 吳涵, 潘風(fēng)光, 王楠 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)