專利名稱：角膜結(jié)膜疾病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有合歡香葉酯(gefarnate)作為活性成分的角膜結(jié)膜疾病治療劑。
背景技術(shù)：
通常，機體通過消化道和呼吸器官等的粘膜表面的分界與外界直接接觸并受到外界微生物和外源物質(zhì)侵襲的危險。機體因此具有保護其粘膜的防御機制。換言之，雖然粘膜僅包被有單層粘膜上層，但上皮細胞總覆蓋有由外分泌腺分泌的外分泌粘液而該外分泌液能夠防止微生物和外源物質(zhì)直接與上皮細胞接觸。在眼部起到上述作用并可潤濕眼球表面的是眼淚。
淚層由油性層、水層和粘液層三層組成并且角膜結(jié)膜上皮細胞緊鄰于粘液層。構(gòu)成粘液層的粘蛋白是一種由結(jié)膜杯形細胞分泌的糖蛋白。已發(fā)現(xiàn)粘蛋白層覆蓋在疏水性角膜結(jié)膜上皮細胞表面并使上皮細胞變性為親水性以利于淚中水層的保持和擴張，從而其對維持眼淚正常結(jié)構(gòu)起重要作用。(眼科雜志，8,1037-1042(1991))因此，任何能夠促進粘蛋白向淚液內(nèi)分泌的物質(zhì)都可被看作可有效地治療表現(xiàn)為角膜結(jié)膜上皮異常的角膜結(jié)膜疾病，例如干眼(dry eye)病、角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛和角膜潰瘍。
近期已就藥物與粘蛋白生成和分泌間的關(guān)系進行了研究并已有關(guān)于潰瘍治療劑乙溴替丁能夠促進大鼠胃粘蛋白生成和分泌的報導(dǎo)(基因藥物學(xué)(Gen.Pharmac.),24,611-617(1993))，以及有關(guān)粘蛋白參與維生素U抗?jié)冏饔玫耐茰y(日本藥理學(xué)和治療學(xué)，22,4355-4361(1994))。
已公開的合歡香葉酯是一種具有高效抗?jié)冏饔貌⑶铱梢杂行е委熛罎兝缥笣兒褪改c潰瘍的物質(zhì)(日本特許公開28,230/1964)。合歡香葉酯的作用機制被認為是促使酸性粘多糖沉淀在損傷表面從而增加胃粘膜內(nèi)的粘液量(例如己糖胺)以保護粘膜等，并且使內(nèi)源性前列腺素增多(藥物醫(yī)學(xué)，4,45-48(1986))。
然而，至今未有關(guān)于眼科學(xué)領(lǐng)域的研究報導(dǎo)。
雖然已進行了許多關(guān)于包括干眼癥在內(nèi)的角膜結(jié)膜疾病治療劑的研究，但發(fā)現(xiàn)具有促進眼組織內(nèi)粘蛋白生成和分泌作用的新物質(zhì)十分令人感興趣。
本發(fā)明詳述本發(fā)明著重研究應(yīng)用于粘膜保護領(lǐng)域的潰瘍治療劑對眼組織內(nèi)粘蛋白生成和分泌所產(chǎn)生的影響作用，并且觀察到合歡香葉酯的促角膜結(jié)膜內(nèi)粘蛋白生成和分泌活性且由此發(fā)現(xiàn)其是一種治療角膜結(jié)膜疾病例如干眼癥、角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛和角膜潰瘍疾病的有效治療劑。
雖然合歡香葉酯的促眼組織內(nèi)粘蛋白生成和分泌作用的詳細內(nèi)容將在藥理學(xué)試驗段落中給出，但在采用存在于角膜上皮內(nèi)的放射性同位素標記硫酸根離子的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)合歡香葉酯能夠引發(fā)含有粘蛋白的蛋白質(zhì)(該蛋白在下文中將稱為“含粘蛋白蛋白質(zhì)”)的分泌。當(dāng)將球結(jié)膜最外層回收并且通過壓跡細胞學(xué)方法觀察時會同時發(fā)現(xiàn)合歡香葉酯使球結(jié)膜內(nèi)的含粘蛋白杯狀細胞量增加。
合歡香葉酯劑型的實例包括眼用制劑，例如眼用溶液和眼用軟膏和注射液，并且這些制劑的制備可以采用多種方法。在眼用溶液中，例如可根據(jù)需要采用等滲劑，例如氯化鈉和濃甘油；緩沖劑，例如磷酸鈉和乙酸鈉；表面活性劑，例如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(下文中將稱為“聚山梨酯80”)、硬脂酸-40-聚烴氧基酯和聚氧乙烯氫化蓖麻油；穩(wěn)定劑，例如檸檬酸鈉和乙二胺四乙酸鈉；防腐劑，例如苯扎氯銨和對羥基苯甲酸酯；等等。pH介于眼用制劑可接受范圍內(nèi)并且優(yōu)選在4-8之間。
要根據(jù)病癥、年齡、劑型等選擇適當(dāng)?shù)膭┝俊τ谘塾萌芤?，每天用濃度?.01-5％(w/v)優(yōu)選0.1-3％的溶液滴眼一至數(shù)次。對于注射液，以0.0001-5mg、優(yōu)選0.001-1mg的劑量每天給藥一至數(shù)次。
本發(fā)明最佳實施例下文中，制劑實施例和藥理學(xué)試驗的結(jié)果都僅用來更好理解本發(fā)明用而不作為本發(fā)明保護范圍的限定。[制劑實施例]制備合歡香葉酯的眼用溶液和眼用軟膏的代表性實施例如下所述1)眼用溶液配方1(制劑1)(10ml)合歡香葉酯 10mg氯化鈉 90mg聚山梨酯80 50mg無菌純水 適量配方2(制劑2)(10ml)合歡香葉酯 30mg氯化鈉 90mg聚山梨酯80 50mg無菌純水 適量配方3(制劑3)(10ml)合歡香葉酯 100mg氯化鈉 90mg聚山梨酯80 50mg無菌純水 適量配方4(制劑4)(10ml)合歡香葉酯 300mg氯化鈉 90mg聚山梨酯80 50mg無菌純水 適量2)眼用軟膏配方5(制劑5)(100g)
合歡香葉酯 1g液體石蠟 10g白礦脂 84g純化羊毛脂 5g[藥理學(xué)試驗]為測定合歡香葉酯的作用功效研究了該化合物對角膜上皮和球結(jié)膜內(nèi)的粘蛋白生成和分泌的影響。1．角膜上皮內(nèi)粘蛋白的生成和分泌已公開的試驗方法是將放射性同位素([35S])標記的硫酸根離子摻入到組織內(nèi)，分離出含粘蛋白蛋白質(zhì)并以該類蛋白質(zhì)的量為依據(jù)來評估粘蛋白含量(生物化學(xué)雜志，257,4709-4718(1982)；美國生理學(xué)雜志，244,C391-C398(1983))。
按照現(xiàn)有文獻所述的方法研究合歡香葉酯對角膜上皮的粘蛋白生成和分泌的影響作用，研究方法中采用下述大鼠的角膜并用dolichosmamerectin法(下文簡寫為DBA)分離出分泌的含粘蛋白蛋白質(zhì)。(試驗方法)從雄性Sprague-Dawley品系大鼠的角膜分離出直徑為3mm的角膜片(每組5-6片)并在37℃下放置于有5％CO2存在的培養(yǎng)基(TC-199)內(nèi)培養(yǎng)6小時。然后，向該培養(yǎng)基中加入[35S]標記硫酸鈉并且進一步培養(yǎng)18小時以使[35S]硫酸根離子全部摻入角膜片內(nèi)。除去培養(yǎng)基，組織用磷酸鹽緩沖的生理鹽水溶液洗滌。再向所得組織中分別加入含不同濃度的合歡香葉酯的培養(yǎng)基且繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。隨后，在培養(yǎng)基中加入DBA固定的凝膠并在室溫下振搖混合物。振搖后回收凝膠，用液體閃爍計數(shù)器測定包含凝膠鍵合[35S]硫酸根離子的含粘蛋白蛋白質(zhì)的放射性活度。(結(jié)果)作為試驗結(jié)果實施例，表1列出培養(yǎng)基內(nèi)合歡香葉酯濃度分別為0.01和0.1mg/ml時的每單位角膜濕重的[35S]硫酸根離子放射性活度。同時，表中數(shù)據(jù)是以未經(jīng)待測化合物處理的每單位角膜濕重的[35S]硫酸根離子放射性活度為100計的計算值。
表1

從表1可明顯看出，加入合歡香葉酯后，含凝膠鍵合[35S]硫酸根離子的含粘蛋白蛋白質(zhì)的放射性活度增強，由此推斷出對含粘蛋白蛋白質(zhì)分泌的促進作用。該作用強度依賴于合歡香葉酯的濃度。
上述結(jié)論清楚地表明合歡香葉酯具有優(yōu)異的促角膜上皮內(nèi)粘蛋白生成和分泌的活性。2．球結(jié)膜內(nèi)粘蛋白的生成和分泌已公開的試驗方法是通過多種染色方法進行壓跡細胞學(xué)測定以驗證結(jié)膜狀況，所謂壓跡細胞學(xué)是一種侵染力很低的生物體表面的活組織檢查方法并且可以利用乙酸纖維素濾紙反復(fù)操作(眼科學(xué)，92,728-733(1985)；和眼科雜志，11,1163-1167(1994))。
現(xiàn)在，按照現(xiàn)有文獻所述的方法對用過碘酸-希夫染色法(下文中簡稱為PAS)染色的杯狀細胞數(shù)量進行壓跡細胞學(xué)測定以研究合歡香葉酯對球結(jié)膜內(nèi)粘蛋白生成和分泌的影響。(試驗方法)用合歡香葉酯眼用溶液在一周中的每天內(nèi)對雄性日本白兔雙眼滴液6次。在最后一次滴液的第二天，將裁成3×3mm大小的乙酸纖維素濾紙放置在已常規(guī)麻醉兔子的鼻側(cè)球結(jié)膜上并且輕輕按壓數(shù)秒。該濾紙從結(jié)膜轉(zhuǎn)移開并浸漬在37％甲醛∶乙酸∶70％乙醇=1∶1∶20的混合物中，然后用乙醇脫水。隨后浸漬在0.5％過碘酸中并用希夫試劑染色。濾紙用乙醇脫水，再浸漬于二甲苯中，然后嵌置在載玻片上。在光學(xué)顯微鏡下觀察用PAS染色的杯狀細胞并對它們進行照相。(結(jié)果)作為試驗結(jié)果例，表2列出了配方1(合歡香葉酯眼用溶液)(合歡香葉酯濃度0.1％(w/v))和配方3(同上)(合歡香葉酯濃度1％(w/v))施用組的每平方毫米上的杯狀細胞數(shù)量。同時還給出未用眼用溶液處理的空白對照組的每平方毫米杯狀細胞的數(shù)量。表2

從表2可明顯看出，配方3的滴眼液提高了球結(jié)膜上杯狀細胞的密度，由此可推斷出其具有增加細胞數(shù)量的作用。
因此，可清楚地看出合歡香葉酯能夠使球結(jié)膜內(nèi)的含粘蛋白杯狀細胞增多，并且顯示出優(yōu)異的促球結(jié)膜內(nèi)粘蛋白生成和分泌的活性。
由上述藥理學(xué)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)合歡香葉酯能夠促進角膜和結(jié)膜內(nèi)的粘蛋白生成和分泌，同時可作為治療干眼癥和其他角膜結(jié)膜疾病例如角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛和角膜潰瘍的有效藥物。
工業(yè)實用性本發(fā)明涉及含有合歡香葉酯作為活性成分的角膜結(jié)膜疾病治療劑。本發(fā)明所述的角膜結(jié)膜疾病治療劑可應(yīng)用于干眼病、角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛、角膜潰瘍等疾病。
權(quán)利要求
1．一種含有合歡香葉酯作為活性成分的角膜結(jié)膜疾病治療劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜結(jié)膜疾病治療劑，其中的角膜結(jié)膜疾病是干眼癥、角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛、角膜潰瘍。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜結(jié)膜疾病治療劑，其中，角膜結(jié)膜疾病是干眼癥。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的任一角膜結(jié)膜疾病治療劑，其中的劑型為眼用溶液。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的角膜結(jié)膜疾病治療劑，其中合歡香葉酯濃度為0.1-3％重量/體積。
全文摘要
一種促進眼組織內(nèi)粘蛋白生成和分泌的新物質(zhì)。含有合歡香葉酯作為活性成分的角膜結(jié)膜疾病治療劑,用于治療干眼癥、角膜炎、結(jié)膜炎、角膜糜爛、角膜潰瘍等。優(yōu)選的劑型是眼用溶液。合歡香葉酯濃度為0.1—3%重量/體積。
文檔編號A61K31/231GK1209743SQ9719181
公開日1999年3月3日 申請日期1997年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月22日
發(fā)明者中田勝彥, 中村雅胤, 濱野孝 申請人:參天制藥株式會社