專利名稱：一種中和犬瘟熱病毒的單克隆抗體及抗體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中和犬瘟熱病毒(⑶V)單克隆抗體2G3及抗體組合物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)。具體為單克隆抗體2G3對CDV具有高的中和活性，與另一種作用于CDV不同抗原表位的中和單克隆抗體1D7組合產(chǎn)生抗病毒協(xié)同增強(qiáng)作用，中和能力得到提高，中和CDV毒株范圍廣泛，可應(yīng)用于犬瘟熱(CD)發(fā)病動物的臨床治療。
背景技術(shù)：
犬瘟熱病毒(⑶V)是引起犬、狐貍和水貂等多種動物發(fā)生犬瘟熱(⑶)的病原，可感染動物體內(nèi)多種細(xì)胞和組織，以淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的親嗜最強(qiáng)，是一種泛嗜性病毒，對動物危害極大。CDV在病毒學(xué)分類上屬于副黏病毒科麻疫病毒屬，為不分節(jié)的負(fù)鏈RNA,主要編碼核衣殼蛋白(N)、融合蛋白(F)、血凝或附著蛋白(H)、基質(zhì)膜蛋白(M)、大蛋白(L)和磷蛋白(P)。病毒RNA被螺旋狀衣殼包裹，由N蛋白、P蛋白和L蛋白組成，N蛋白是病毒蛋白中含量最多、保守性最強(qiáng)的免疫原性蛋白，P蛋白和L蛋白則具有聚合酶活性。病毒囊膜表面的H和F蛋白通過M蛋白與核衣殼連接，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中起作用。CDV只有一個血清型，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，目前CDV主要流行毒株與免疫預(yù)防使用的弱毒疫苗株存在不同程度的抗原性差異。犬瘟熱幾乎分布世界各國，自然宿主廣泛，傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高，并可引起機(jī)體免疫抑制，繼發(fā)或混合感染其它病原。近年來，我國寵物犬、警犬、實(shí)驗用犬等的飼養(yǎng)量不斷增加，以水貂、狐、貉等為飼養(yǎng)對象的經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖業(yè)也迅猛發(fā)展。然而犬瘟熱在我國的發(fā)病率卻有升高的趨勢，該病不僅在非免疫動物中發(fā)病率和致死率很高，而且用弱毒疫苗免疫動物也未能得到完全保護(hù)，有許多免疫動物群體暴發(fā)犬瘟熱，損失十分慘重。此夕卜，隨著⑶V自然感染的宿主范圍不斷擴(kuò)大，熊貓、熊、獅子和老虎等珍稀野生動物也經(jīng)常發(fā)生犬瘟熱，嚴(yán)重危害我國野生動物保護(hù)業(yè)的健康發(fā)展。發(fā)生犬瘟熱的動物，種類和數(shù)量較多，經(jīng)濟(jì)價值較高，有些伴侶動物(如寵物犬等)被視為家庭成員，因此對犬瘟熱除了積極的預(yù)防外，有必要對患病動物進(jìn)行有效的治療，將損失降到最小。犬瘟熱是一種病毒性傳染病，一旦發(fā)病還沒有特效的治療藥物，發(fā)病時用特異性抗體進(jìn)行治療是主要的方法。犬瘟熱病毒的高免血清常用于治療犬瘟熱，但制備成本較高，易傳播其它病毒，抗體中和效價參差不齊，難以標(biāo)準(zhǔn)化。因此制備特異性好，抗體中和效價高，易于標(biāo)準(zhǔn)化，制備成本低的單克隆抗體是必然選擇。近幾年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，CDV流行毒株與疫苗毒株之間存在變異導(dǎo)致不同程度的抗原性差異，單克隆抗體只針對病毒的單一抗原表位，因此存在單克隆抗體因病毒抗原表位變異而失去中和作用，不能有效殺滅病毒的風(fēng)險。聯(lián)合使用針對不同抗原表位的兩種或兩種以上的單克隆抗體，可以避免或減少因病毒抗原性差異導(dǎo)致的治療失敗，獲得更好的療效。另外，使用兩種或兩種以上的單克隆抗體還有可能產(chǎn)生抗病毒協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，增強(qiáng)抗體中和病毒的能力。美國FDA批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物CL184組合就是采用CR57和CR4098兩個單克隆抗體的混合物治療狂犬病毒感染，取得了跟市售高免疫血清中提取的免疫球蛋白制品相似或更好的效果。
之前，我們用新分離的CDV NJOl株作為免疫原制備犬瘟熱病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫，從中篩選到一株分泌高中和活性犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1D7株，用其制備的單克隆抗體1D7可以中和不同動物源的CDV毒株。本發(fā)明又篩選制備了另一種中和犬瘟熱病毒的單克隆抗體2G3，與單克隆抗體1D7識別作用的CDV抗原表位不同，而且將單克隆抗體2G3與單克隆抗體1D7進(jìn)行組合，產(chǎn)生抗病毒協(xié)同增強(qiáng)作用，中和病毒的能力得到增強(qiáng)，抗犬瘟熱病毒毒株的范圍更廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
犬瘟熱是犬和肉食目中多種動物的一種高度接觸性傳染病，盡管免疫預(yù)防是防控該病的指導(dǎo)原則，但最近幾年卻不斷有免疫動物發(fā)生犬瘟熱的狀況。因此要對犬瘟熱發(fā)病動物進(jìn)行及時有效地治療。目前臨床上主要采用犬瘟熱的高免血清和單克隆抗體對其進(jìn)行治療。犬瘟熱高免血清存在生產(chǎn)成本偏高，易傳播血源性疾病，中和效價參差不齊，難以標(biāo)準(zhǔn)化等問題，單克隆抗體可以彌補(bǔ)以上缺陷，但單克隆抗體識別作用抗原位點(diǎn)單一，使用一種單克隆抗體治療犬瘟熱，可能對不斷出現(xiàn)的犬瘟熱病毒變異株失去中和能力。本發(fā)明的目的是提供一種中和CDV的單克隆抗體及抗體組合物。該單克隆抗體是通過病毒中和試驗從建立的CDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫中篩選得到的，與另一種識別作用CDV不同抗原表位的單克隆抗體組合，中和能力得到顯著增強(qiáng)，抗犬瘟熱病毒毒株的范圍更廣泛。
技術(shù)方案
為達(dá)到以上目的，是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種中和犬瘟熱病毒的單克隆 抗體2G3，該單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQID NO:1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示；編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)氨基酸的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。所述的單克隆抗體2G3及抗體組合物是由雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清法制備的。該單克隆抗體2G3對犬瘟熱病毒具有病毒中和活性，中和效價高，與犬瘟熱病毒反應(yīng)特異性良好。 經(jīng)鑒定，該犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3與雜交瘤細(xì)胞1D7株(一種分泌高中和活性犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1D7株.國家發(fā)明專利申請?zhí)?01210081170. 8，公開號CN102618503A，
公開日2012. 08. 01)分泌的犬瘟熱病毒單克隆抗體1D7結(jié)合的犬瘟熱病毒抗原表位是不同的。該犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3與雜交瘤細(xì)胞株1D7制備的犬瘟熱病毒單克隆抗體1D7按1:1的比例混合均勻，制備成單克隆抗體組合物，該抗體組合物對犬瘟熱病毒的中和能力顯著增強(qiáng)。所述的中和犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3可在制備臨床治療犬瘟熱發(fā)病動物的藥物中得到應(yīng)用。所述中和犬瘟熱病毒的抗體組合物可在制備臨床治療犬瘟熱發(fā)病動物的藥物中得到應(yīng)用。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下1.本發(fā)明的犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3對犬瘟熱病毒具有高的中和活性。2.本發(fā)明的犬痕熱病毒單克隆抗體2G3與雜交瘤細(xì)胞1D7株分泌的犬痕熱病毒單克隆抗體識別作用于犬瘟熱病毒不同的抗原表位，將兩種單克隆抗體混合制備成抗體組合物可克服單克隆抗體識別抗原位點(diǎn)的單一性，避免病毒變異導(dǎo)致單克隆抗體無中和能力。3.本發(fā)明的抗體組合物中和效價中和效價為212，顯著高于(4倍)分別使用單種單克隆抗體2G3或1D7的中和效價(單克隆抗體2G3和1D7的中和效價均為21(1)，抗體組合物的中和病毒能力更強(qiáng)。4.本發(fā)明的抗體組合物用于臨床治療，中和犬瘟熱病毒的范圍和能力增強(qiáng)，降低生產(chǎn)成本，提高治療效果，臨床應(yīng)用范圍更廣泛。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立1. CDV抗原的制備將CDV NJOl強(qiáng)毒株(畢振威等，非典型犬瘟熱病毒核衣殼蛋白 基因序列分析及其在大腸桿菌中的表達(dá).中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33(8) : 625-629.)接種于Veix)細(xì)胞，3d細(xì)胞發(fā)病變(CPE)，5d后收毒。將病變的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，4000 Xg離心后去除細(xì)胞碎片。病毒上清液經(jīng)IM醋酸鋅溶液沉淀后，用飽和EDTA溶液重新懸浮沉淀，4°C條件下，49000Xg離心60min，沉淀用NTE充分懸浮。加入20%、30%、40%、50%和60% (質(zhì)量/體積)的密度梯度蔗糖溶液，61000Xg離心90 min。吸取病毒帶，通過電鏡負(fù)染觀察病毒形態(tài)，并用分光光度計測定病毒濃度，置-70°C保存?zhèn)溆谩?.動物免疫用純化的⑶V NJOl株作為免疫原，腹腔注射免疫6 8周齡雌性BALB/c小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗中心)，50iig/只。首免用等體積弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d斷尾采血，測定血清抗體效價。選取血清抗體效價> IO6的小鼠，融合前3d用不加佐劑的抗原腹腔加強(qiáng)免疫，劑量加倍(100 u g/只)。3.細(xì)胞融合采用PEG細(xì)胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1: 5 1: 10的比例充分混勻，在45s內(nèi)加完預(yù)熱至40°C的50% PEG-4000(Sigma公司產(chǎn)品)ImL,邊加邊輕輕振蕩,然后在90s內(nèi)加入15mL預(yù)熱至37°C的無胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，室溫靜置10min，l，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入含15% FCS(蘭州民海公司產(chǎn)品)和HAT (Sigma公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸，分裝到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后補(bǔ)加含HAT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS(蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，5d后改用含HT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS(蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，IOd后換成含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)融合的細(xì)胞生長至96孔板孔底面積的1/5時，取上清進(jìn)行抗體檢測。4.雜交瘤細(xì)胞的篩選按方陣法確定純化抗原的包被濃度，用包被液為0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對純化的⑶V抗原進(jìn)行倍比稀釋，用稀釋至400倍的抗原量包被ELISA板，100 U L/孔，置4°C包被過夜(不少于12h)，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封閉每孔，200 u L/孔，37°C放置2h，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將融合后12d的細(xì)胞上清、I 1600稀釋的免疫小鼠陽性血清和
I 1600稀釋的小鼠陰性血清，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 UL/孔，37°C作用lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入1: 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(本試驗室自制)，IOOii L/孔，37°C放置lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H2O2,100 u L/孔，室溫避光顯色20min ;每孔加入50 y L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值，以空白對照調(diào)零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的OD45tlnm值，當(dāng)陰性參考血清的OD45tol值=0. 1，陽性參考血清的OD45tlnm值與陰性參考血清的OD45tol值的比值蘭2. 1，即陰、陽性對照成立的前提下，P/N ^ 2.1的檢測孔判為陽性，1. 5彡P(guān)/N< 2.1的檢測孔判為可疑，P/N <1. 5的檢測孔判為陰性。隔2 3d后再檢測一次，選擇兩次檢測結(jié)果均為陽性的雜交瘤細(xì)胞株。5.雜交瘤細(xì)胞的克隆化首先將陽性孔活細(xì)胞用臺盼蘭進(jìn)行染色和計數(shù)，用含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基稀釋成100個細(xì)胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0. 15mL，37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 5d后，顯微鏡下可觀察到克隆細(xì)胞的形成，記錄下只有單個克隆生長孔，8 9d時取細(xì)胞上清，及時進(jìn)行ELISA檢測。選擇陽性的單克隆細(xì)胞再進(jìn)行同樣的克隆3次以上，直至克隆后所有細(xì)胞孔上清檢測均為陽性、且各孔檢測OD值較接近。將克隆化的CDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存，建立了 82株穩(wěn)定分泌CDV特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫。6.單克隆抗體的制備` 采用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清法制備單克隆抗體。將分泌犬瘟熱病毒特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用含15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度生長達(dá)80%-90% (細(xì)胞濃度約為2 X IO6個/mL)時，將培養(yǎng)基換成無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，放置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)直到所有細(xì)胞死亡，將培養(yǎng)液IOOOrpm離心IOmin,取單克隆抗體上清于_20°C保存?zhèn)溆谩?.中和活性單克隆抗體的篩選
采用固定病毒稀釋抗體的方法進(jìn)行細(xì)胞微量病毒中和試驗。將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將2倍倍比稀釋的單克隆抗體與等體積含200 TCID5tl的犬瘟熱病毒液混合均勻，37°C作用lh，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀察結(jié)果。結(jié)果篩選到一種中和效價高的單克隆抗體2G3，其對犬瘟熱病毒的中和效價為21CI。實(shí)施例_■:單克隆抗體2G3可變區(qū)基因的克隆和序列測定1.雜交瘤細(xì)胞RNA的提取
將分泌單克隆抗體2G3的雜交瘤細(xì)胞2G3株用含15% FCS(蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用適量PBS將細(xì)胞吹打下來，置于-2CTC冰箱凍融 3 次。按 TRIZOL Reagent (InvitrogenTM Life technologies)試劑使用方法提取總RNA。2. RT-PCR法擴(kuò)增單克隆抗體的VL和VH基因
設(shè)計單克隆抗體輕鏈可變區(qū)上游引物VL F和下游引物VL B以及重鏈鏈可變區(qū)上游引物VH F和下游引物VH B兩對引物,并送至上海Invitrogen公司合成。引物序列如下
VL F :5’ -GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’
VL B :5’ -AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’
VH F :5’ -GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’
VH B :5’ -CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’
(IUB標(biāo)準(zhǔn)兼并堿基代碼Y C/T ； R A/G ；)
用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Promega公司)對提取的雜交瘤細(xì)胞2G3的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增單克隆抗體2G3的VL和VH基因。PCR 反應(yīng)體積 50 ii I，反應(yīng)條件為94°C 5min ；95°C 40s, 58°C 40s, 72°C lmin，循環(huán) 35 次；72 °C 7min。3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選
PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒(購自TaKaRa公司)回收，與pMD18-T simple Vector (購自TakaRa公司)連接后轉(zhuǎn)化萬.co7i DH5 a感受態(tài)細(xì)胞(購自Invitrogen公司),涂布于1. 5%瓊脂LB平板(含Amp100 u g/mL), 37°C培養(yǎng)過夜。挑白色單菌落在Amp抗性LB培養(yǎng)基中37°C搖菌過夜，以I y菌液為模板，通過上述針對輕鏈、重鏈可變區(qū)設(shè)計的引物，用PCR法篩選重組陽性克隆，將所獲得重組陽性克隆送交上海Invitrogen公司完成基因序列測定。測序結(jié)果為輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。實(shí)施例三單克隆抗體2G3的生物學(xué)特性1.單克隆抗體的特異性鑒定
采用間接免疫熒光試驗驗證單克隆抗體2G3是否與Vero細(xì)胞反應(yīng)。用CDV感染Vero細(xì)胞，培養(yǎng)72h病變后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)液洗2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入-20°C預(yù)冷的無水乙醇ImL/孔，4°C固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入單克隆抗體2G3，37°C孵育lh，PBS洗滌3次，拍干；加入200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(購買于武漢博士德生物工程有限公司)，37°C孵育lh，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。單克隆抗體2G3與CDV感染的Vero細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，而與正常Vero細(xì)胞無熒光。用間接ELISA方法驗證單克隆抗體是否與其它病毒有交叉反應(yīng)。用0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液分別包被犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒I型(CAV-1)和犬冠狀病毒(CCV)作為抗原，加入單克隆抗體2G3作用lh，PBST洗滌拍干，以酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體(本實(shí)驗室自制)作為指示抗體作用lh，底物TMB- H2O2顯色，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD45tol值，結(jié)果以CPV、CPIV、CAV-1和CCV為抗原檢測單克隆抗體2G3的OD45tol值均小于0. 1，判為陰性，而以⑶V為抗原檢測單克隆抗體2G3的OD45tlnm值為1. 0，判為陽性，證明單克隆抗體2G3是抗CDV的特異性單克隆抗體。2.單克隆抗體的類型測定
亞類測定按照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(購買于Thermo scientific公司)操作說明書進(jìn)行，結(jié)果顯示，單克隆抗體2G3亞類為IgGl K。
3.單克隆抗體效價和穩(wěn)定性測定
將分泌單克隆抗體2G3的雜交瘤細(xì)胞2G3株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)傳代20次、液氮凍存與復(fù)蘇試驗，以純化的CDV抗原為檢測抗原，間接ELISA連續(xù)檢測單克隆抗體2G3效價，結(jié)果各傳代的抗體ELISA效價相同，達(dá)到IO4。4.單克隆抗體中和活性的測定
采用固定病毒稀釋抗體的方法進(jìn)行細(xì)胞微量病毒中和試驗。將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將2倍倍比稀釋的單克隆抗體2G3與等體積含200 TCID5tl的犬瘟熱病毒懸液混合均勻，37°C作用lh，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，結(jié)果單克隆抗體2G3對⑶V的中和效價為21(1。5.單克隆抗體針對抗原表位的分析
采用間接ELISA相加試驗分析單克隆抗體2G3與1D7結(jié)合抗原表位的差異。根據(jù)單克隆抗體2G3和1D7的ELISA抗體效價，將其分別稀釋至飽和濃度，在此濃度下各取50%混勻，分別測定混合的單克隆抗體及飽和濃度下單克隆抗體2G3和1D7的OD45tol值。按下列公式分別計算2株單克隆抗體相互疊加后的Al值A(chǔ)l= Al (%) = [ (2A1+2/A1+A2 )-1] X 100,A1和A2是2種單克隆抗體各自的吸收值，A1+2是2種單克隆抗體相加所測得的吸收值。若AK50為2種單克隆抗體結(jié)合同一抗原位點(diǎn)，若AI>50為2種單克隆抗體結(jié)合不同的抗原位點(diǎn)。實(shí)驗結(jié)果為單克隆抗體2G3與1D7的Al為75，大于50，表明2G3與1D7結(jié)合⑶V不同的抗原表位。實(shí)施例四單克隆抗體組合物及中和活性測定1.單克隆抗體2G3和1D7的制備
采用細(xì)胞培養(yǎng)上清法制備單克隆抗體2G3和1D7。將分泌犬瘟熱病毒特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2G3株和1D7株分別在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用含15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) ，待細(xì)胞密度生長達(dá)80%-90% (細(xì)胞濃度約為2 X IO6個/mL)時，將培養(yǎng)基換成無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，放置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)直到所有細(xì)胞死亡，分別將培養(yǎng)液IOOOrpm離心lOmin，取上清于_20°C保存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體組合物的制備
將用細(xì)胞培養(yǎng)上清法制備的單克隆抗體2G3和單克隆抗體1D7按1:1體積比充分混合均勻，制備單克隆抗體組合物。3.單克隆抗體及組合物中和活性的測定
用Vero細(xì)胞微量病毒中和試驗分別測定細(xì)胞培養(yǎng)上清法制備的單克隆抗體2G3、單克隆抗體1D7以及單克隆抗體2G3和1D7組合物的中和效價。將Vero細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將2倍倍比稀釋的各待測抗體分別與等體積含200 TCID5tl的犬瘟熱病毒懸液混合均勻，37°C作用lh，取該病毒-抗體混懸液每孔0.1ml接種于上述96孔細(xì)胞板中，并設(shè)立⑶V及正常Vero細(xì)胞對照，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)觀察，結(jié)果見表一，單克隆抗體2G3和1D7組合物對⑶V的中和效價為212，顯著高(4倍)于分別使用單種單克隆抗體2G3或1D7的中和效價(單克隆抗體2G3和1D7的中和效價均為21(1)。
表一單克隆抗體中和效價比較單克隆抗體|2G3|lD7|2G3和1D7組合物 中和效價 1# |210 |212—
SEQ ID NO.1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列
Asp He Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg AlaThr He Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His TrpAsn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Asn Leu GluSer Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu AsnHe His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His He Arg Glu LeuTyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro SerSEQ ID NO. 2重鏈可變區(qū)氨基酸序列
Leu Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser LeuSer Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser He Ala Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp IleArg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Leu Gly Tyr He Ser Tyr Asp Asp IleSer Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Asp Arg He Phe He Thr Arg Asp Thr Ser Lys AsnGln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys AlaArg Glu Lys Glu Thr Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser AlaSer Thr Lys Gly Pro Ser
SEQ ID NO. 3輕鏈可變區(qū)核苷酸序列
gggcccaggcggccgagctcgatattcagatgacacagactcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagctctacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctSEQ ID NO. 4重鏈可變 區(qū)核苷酸序列
gctgcccaaccagccatggccctcgaggtaaagcttctcgagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgtctctcacctgctctgtcactggctactccatcgccagtggttattactggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggaatggttgggctacataagctacgacgatatcagtaactccaacccatctctcaaagatcgaatcttcatcactcgtgacacatctaagaaccagtttttcctgaagctgaattctgtgacttctgaggacacagctacatattattgtgcaagagagaaagaaactgggaggtggggccaagggaccactctcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcg
權(quán)利要求
1.一種中和犬瘟熱病毒的單克隆抗體2G3，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中和犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3，其特征在于，編碼單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)氨基酸的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
3.一種中和犬瘟熱病毒的抗體組合物，其特征在于，該抗體組合物含有權(quán)利要求1所述的中和犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中和犬瘟熱病毒的抗體組合物，其特征在于，該抗體組合物還含有單克隆抗體1D7。
5.權(quán)利要求1或2所述的中和犬瘟熱病毒單克隆抗體2G3在制備臨床治療犬瘟熱發(fā)病動物的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述中和犬瘟熱病毒的抗體組合物在制備臨床治療犬瘟熱發(fā)病動物的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中和犬瘟熱病毒(CDV)的單克隆抗體及抗體組合物，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的單克隆抗體2G3具有高的中和犬瘟熱病毒活性，與篩選的另一株雜交瘤細(xì)胞1D7株制備的中和CDV單克隆抗體識別作用CDV不同的抗原表位。將兩種單克隆抗體制成抗體組合物，對犬瘟熱病毒的中和能力明顯優(yōu)于其組分中的單種單克隆抗體2G3和1D7，兩者組合后能產(chǎn)生抗病毒協(xié)同增強(qiáng)作用，中和犬瘟熱病毒的范圍和能力均得到增強(qiáng)。用本發(fā)明的單克隆抗體制備抗體組合物治療臨床犬瘟熱發(fā)病動物，中和病毒能力更強(qiáng)，可避免犬瘟熱病毒變異導(dǎo)致單克隆抗體失效，臨床應(yīng)用范圍更廣泛。
文檔編號A61K39/42GK103059133SQ20131003657
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者畢振威, 夏興霞, 王永山, 潘群興, 諸玉梅, 董晨紅, 歐陽偉, 王曉麗, 徐立波 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院